血小板活化释放因子在血小板功能测试中的应用

曾俊玲，许小冰 综述 陈煜森 审校

广东医科大学附属医院神经内科，广东 湛江 524000

血小板主要生理功能在于止血、维持血管内皮完整性，同时是病理血栓形成的重要因素。通过血小板功能预测患者不良心血管事件的风险等有着重要的临床意义，目前临床实验室提供的血小板功能测试(platelet function tests，PFT)方法中，测量血小板聚集占主导地位，且大多数测试方法的结果存在显著的异质性，尚无明确的标准化测试。血小板活化触发血栓形成，活化的血小板水平和能力是预测血栓形成事件的有用指标[1]，深入了解测量血小板活化在PFT 中的应用将有助于开发更具有标准化的测试。

1 血小板功能测试研究现状

1910 年，Duke 将出血时间用于评估血栓形成能力，是历史上第一个PFT 方法[2]。直至1963 年PFT 有了突破性的进展，BORN[3]推出了首个测量血小板聚集的方法-光学比浊法(light transmission aggregometry，LTA)，曾被认为是PFT的金标准，但LTA不能显示血小板的活化，受到血小板计数的影响，需要较多的血液标本量，繁琐的程序不允许同时自动测量或评估大量样品[4-6]。近20 年来，PFT 得到了改进，根据不同的病理机制开展了许多测量血小板黏附、聚集的PFT方法，例如多电极聚集法、血小板功能检测仪-100、血栓弹力图等，这些方法不像LTA 那样繁琐，可用于床旁快速分析血小板功能，但也无法显示血小板的体内活化，高度依赖于血小板计数。目前，测量血小板活化的流式细胞术在减少血液消耗、血小板减少症患者中的应用有了重大改进，该方法分析单个血小板的功能，测量单个血小板上血小板活化标志物的表达，这在很大程度上独立于血小板计数，可作为基于血小板聚集测量的PFT 的首选替代方案[6-7]。流式细胞术作为量化血小板活化水平的可靠技术，使得血小板活化分析在PFT中的应用显示出了前景。

2 血小板活化在血栓形成中起关键作用

血小板活化是一个复杂的多因素过程，涉及黏附、释放、聚集等多种途径。首先，血小板黏附在受损的血管壁上，黏附蛋白和可溶性激动剂与其各自血小板膜受体的结合后传导信号触发血小板活化[8]。这些诱导血小板活化信号的传导机制、放大网络及各信号传导之间串扰的确切性质是一个值得深入探索的重要领域，有助于揭示血栓疾病的新治疗靶点。其次，血小板活化后，血小板膜上的磷脂酶A2 分解花生四烯酸，释放出血栓烷A2 (thromboxane A2，TXA2)，可将循环血小板募集到血凝块中，并诱导血管平滑肌收缩，加速止血过程[9]。此外，血小板还从各种存储颗粒、细胞外囊泡及血小板膜蛋白的水解脱落释放生物活性因子。血小板包含三种主要类型的存储颗粒：α-颗粒、δ-颗粒和溶酶体，当颗粒膜与血小板表面或开放小管系统中的质膜融合时，颗粒能够将可溶性颗粒分子释放到细胞外液中，如5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、血小板因子-4 (platelet factor 4，PF4)、β-血栓球蛋白(βthromboglobulin，β-TG)等，一些膜结合颗粒分子则黏附在活化血小板表面表达，如P-选择素(P-selectin，Psel)等[10]，这些释放的因子能够增强血小板活化信号，激活处于休眠状态的血小板，极大地促进了血栓的形成[11]。血小板活化后通过血小板衍生的细胞外囊泡(platelet extracellular vesicle，PEVs)释放的微粒、外泌体，能介导细胞通讯，具有促血栓形成活性[12]。长时间强烈刺激血小板活化后，金属蛋白酶介导血小板膜蛋白受体的水解释放出可溶性脱落蛋白，如可溶性糖蛋白VI (soluble glycoprotein VI，sGPVI)、可溶性糖蛋白V(soluble glycoprotein V，sGPV)等，可促进凝血因子与血小板的结合、凝血酶和纤维蛋白的形成[13]。近年来，血小板蛋白质组的研究进展迅速，对血小板活化释放的生物活性因子的研究越来越多，促进了血小板活化释放因子在PFT中的发展。最终，激动剂激活血小板触发的信号通路汇聚为共同通路，诱导“由内而外”的信号传导过程，激活糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 的配体结合功能，介导血小板聚集并触发“由外向内”信号传导，导致血小板扩散、凝块收缩，形成稳定血栓[14]。

3 血小板活化释放因子在血小板功能测试中的临床应用

血栓形成由血小板活化触发，血小板活化中的释放反应是关键步骤，血小板活化释放因子在放大血小板活化、募集循环血小板聚集、稳定血栓起着关键作用。血小板活化释放因子水平变化与血小板功能密切相关，可作为PFT的生物标志物。

3.1 血栓性疾病患者的血小板功能测试 血小板活化释放因子水平的升高可用于早期识别血小板功能亢进，预测血栓形成趋势，指导血栓治疗或预防、改善患者临床结局。血小板活化释放因子中研究最多的是α-颗粒释放在血小板表面膜上的P-sel，部分以可溶形式释放到血浆中形成可溶性P-选择素(solubleP-selectin，sP-sel)。暴露在血小板表面膜上的P-sel迅速与白细胞结合，形成的血小板-白细胞聚集体(platelet-leucocyte aggregates，PLA)是比P-sel更敏感的体内血小板活化释放标志物，在晚期动脉粥样硬化、急性冠脉综合征、急性脑梗死、新型冠状病毒-感染并发血栓形成的患者中明显升高[15-18]。与动脉血栓性疾病相比，尽管静脉血栓性疾病传统上认为不是一种依赖于血小板激活的疾病，但血小板在静脉血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE)中的作用仍然是探索热点，RIVA等[19]在随机收取的100例急诊就诊患者样本中显示sP-sel 对VTE 有良好的预测价值，是仅次于D-二聚体最相关的生物标志物。然而SCHORLING等[20]在癌症患者中并未证明sP-sel 对VTE 的预测价值，造成这种差异的可能原因是基线患者特征的不同，有必要对不同人群开展sP-sel 与VET 风险相关性的研究。P-sel 及其衍生物有望成为血栓性疾病中有吸引力的PFT 标志物。测量储存在血小板δ-颗粒中的5-HT释放试验(serotonin release assay，SRA)是专门用于肝素诱导的血小板减少症-Ⅱ(heparin-induced thrombocytopenia Ⅱ，HIT-Ⅱ)、新型冠状病毒疫苗引起的免疫血栓性血小板减少症的PFT 方法[21-22]，5-HT 的水平反映该类患者血小板活化程度，有助于早期识别继发的血栓形成倾向。SRA 虽然视为HIT 诊断的金标准，但技术要求高、耗时长，RUNSER 等[23]在85%的HIT-Ⅱ患者中发现P-sel水平增高，认为是该类患者血小板活化的最佳标志物，用流式细胞术测量P-sel水平替代SRA，是HIT-Ⅱ患者PFT 方法的新兴领域。在过去几十年中，血小板膜蛋白受体水解释放的可溶性脱落蛋白得到了广泛的研究。糖蛋白Ⅵ(glycoproteinⅥ，GPⅥ)和糖蛋白Ib/Ⅸ/V(glycoprotein Ib/Ⅸ/V，GPI b/Ⅸ/V)复合物是血小板黏附阶段重要的血小板表面黏附受体，血小板活化后由酶介导受体脱落释放sGPⅥ、sGPV，在血栓和凝血障碍疾病中升高。红细胞和血小板计数、总胆固醇、吸烟和近期食物摄入量是sGP V水平的重要决定因素，作为PFT 标志物的临床研究中必须加以考虑[24]。相比，由于sGPⅥ血浆水平的稳定性，不受年龄、性别或吸烟的影响，是血栓性疾病中PFT 的一个极好的候选标志物，也可以作为阴性预测因子来排除异常血小板活化[25]。近年来，在血栓性疾病中寻找新的、可靠的PFT 标志物的过程中，有研究发现PEVs 水平与动脉血栓形成、急性缺血性脑卒中等疾病之间存在关联[26-27]，是血小板活化、血栓形成、炎症和内皮功能障碍的新兴标志物，备受关注。迄今为止，这种有前景的标志物缺乏更标准化的测量，随着PEVs分离和检测技术的进步将在血栓性疾病的应用中迎来发展。

3.2 出血性疾病患者的血小板功能测试 评估出血性疾病患者需先对出血史、家族史和体格检查进行客观的临床评估，随后进行血小板计数、凝血等实验室检查均不能完全解释出血症状时，再进一步行血小板功能测试。测量存储颗粒释放因子可用于诊断遗传性血小板功能障碍中的血小板颗粒含量或分泌异常患者，通过测量血小板δ-颗粒中ADP释放和血小板聚集的Lumi-LTA 法，用作临床怀疑血小板功能缺陷患者首选的PFT方法[28]，测量α-颗粒中的PF4 和β-TG 的释放，有助于出血性疾病α-颗粒蛋白异常水解的魁北克血小板病的诊断[29]。通过ELISA 或蛋白质印迹法测量α-颗粒蛋白的水平来评估α-颗粒释放的技术相当繁琐，目前更广泛使用的方法是通过流式细胞术测量α-颗粒释放在血小板表面膜上P-sel，如灰色血小板综合征的诊断[30]。此外，P-sel的测量还可以与其他血小板功能评估相结合，DOVLATOVAL 等[31]认为P-sel 和CD63具有诊断疑似轻度出血性疾病的潜力。血小板膜蛋白受体的水解脱落除了在血栓性疾病的研究之外，另一方面，血小板表面的黏附受体过度水解脱落会降低受体的表面密度，从而减弱血小板信号传导、活化，导致继发性血小板功能障碍。有研究在左心室辅助装置植入、肝素诱导血小板减少症、创伤患者中发现出血并发症与极高水平的sGPⅥ密切相关，病理性剪切力、病理性血小板活化和纤维蛋白沉积等是导致sGPⅥ过度脱落和血小板功能障碍的机制[32-34]，将sGPⅥ确定为该类出血性疾病的PFT标志物，需要更多前瞻性的验证。

3.3 血小板功能测试以监测抗血小板治疗的反应 由于对抗血小板药物治疗的反应存在个体差异，部分患者即使接受规律抗血小板治疗后仍然会再发缺血性事件，血小板持续活化称为治疗后残留血小板的高反应性(hight treatment platelet reactivity，HPR)，通过PFT 可监测抗血小板治疗反应以期指导个体化抗血小板方案，是提高治疗效果的有效手段。阿司匹林通过不可逆地乙酰化血小板环氧化酶-1 从而抑制TXA2 的释放来发挥其主要的抗血栓作用，因此，TXA2的下游代谢物尿11-脱氢血栓烷B2(11-dehydrothromboxane B2，11-dhTxB2)的测量是对阿司匹林的药效反应相对直接的PFT方法，规律服用阿司匹林后尿11-dhTxB2＞1 500 pg/mg被定义为阿司匹林HPR[35]，DHARMASAROJA 等[36]证明通过尿11-dhTxB2检测的阿司匹林HPR患者与心血管不良事件的复发和死亡有关，但基于尿11-dhTxB2检测结果制定的个体化抗血小板方案的效果仍不清楚，WANG等[37]尚未完成随访和数据验证，后续将继续追踪。由于P-sel表达与血小板活化更直接相关，激动剂刺激血小板并测量产生的P-sel 可用于评估抗血小板治疗反应性的整体测量。规律抗血小板治疗后P-sel 的中值荧光(median fluorescence，MF)＞500 U 定义为阿司匹林HPR，MF＞860 U 定义为氯吡格雷HPR，THOMAS等[38]证明基于P-sel 检测的氯吡格雷HPR 与心血管缺血事件复发有关，然而APPLETON等[39]却未在脑缺血事件复发患者中发现与氯吡格雷HPR的关联，后续应在更多不同患病群体中研究，还需进一步研究基于Psel 的检测结果指导个体化抗血小板方案的有效性。此外，KLINKHARDT 等[40]在炎症反应起重要作用的外周动脉闭塞性疾病中认为PLA 可作为监测抗血小板治疗反应的PFT 标志物，但它不适用于短期、急性事件中应用。TOMANIAK 等[41]许多研究表明抗板药物会影响PEVs释放，使用标准化的方法检测PEVs可能成为未来监测抗血小板治疗反应性的另一种PFT实用标志物。

3.4 输血医学、围手术期的血小板功能测试 PFT在输血医学中的主要应用是确定血小板浓缩物(platelet concentrates，PC)的质量，评估血小板功能状态，以保证其输注后止血的能力。在PC储存期间，血小板功能丧失与进行性血小板活化相关，因此，血小板活化后释放因子可用于评估PC 质量的PFT 标志物。KICKEN 等[42]发现PC 质量与P-sel 表达密切相关，与自发性P-sel 表达量呈负相关，与激动剂刺激Psel 表达量呈正相关。此外，越来越多的研究也将sGPV、sGPVI、PLA、PEVs作为PC的质量评估标志物，测量PC 中的PEVs 形成是新兴领域，因为PEVs 除了是血小板活化的标志物，还可以提供PC 老化和功能的定性信息[43]。尽管已经提出了几种不同的用于测量PC 质量的标志物，但尚无评估PC 的黄金标准，因此，需要更多的研究来准确测量PC血小板功能。围手术期血小板功能的测量似乎有助于术后止血控制，减少不必要的血小板输注。KICKEN等[44]将P-sel用作PFT标志物调查血小板功能对结直肠手术后的影响，结果却发现血小板功能与术后出血的发生率、严重程度等无关。未来需要通过大型随机试验进一步研究P-sel及其他血小板活化释放因子是否可以用作围手术期PFT的生物标志物。

4 展望

血小板活化释放因子的测量可以判断体内血小板的基础活化水平评估血小板功能，以更好地预测血栓或出血风险，在检测中加入外源性激动剂后测量还可以分析体外血小板的反应性，以评估药物治疗反应、PC 质量监测等。基于血小板活化释放因子的测量是对现有常用PFT的有用补充，新测定法的潜在临床效用正在显现，但需要进一步的前瞻性研究来明确其应用价值。相信随着研究的不断深入以及新兴技术的发展，未来PFT 一定能够更加规范化，改善临床实践。