基于激光光谱分析的一种水中硝酸盐氮同位素比值测定新方法

袁红朝，贺 珍，张丽萍，耿梅梅，陈 闻，许丽卫，李春勇，彭 灿，王久荣

(中国科学院 亚热带农业生态过程重点实验室，湖南 长沙 410125)

氮是植物生长不可缺少的营养元素，同时也是温室气体N2O排放和水体富营养化(N素)的来源[1-4]。我国部分地区已经出现土壤氮饱和现象并超过了农田生态系统的临界负荷，而农田土壤硝酸盐的淋失被认为是造成湖泊、河流以及地下水硝酸盐污染的主要原因之一[5-6]。水体中硝酸盐污染导致了严重的水生生态和人类健康问题，包括水体富营养化、藻类疯长、鱼虾类缺氧死亡、含氮的温室气体排入环境、饮用水水质恶化等环境问题，已经被人们普遍关注。元素循环过程中同位素组成变化记录了元素转化过程与生物环境影响因子的综合作用[7-8]，氮的同位素在特定的污染源中具有特定的组成，能够相对准确地反映污染物的迁移转化机制[9-14]。因此，测定硝酸盐的氮稳定同位素组成可有效识别其主要来源，可作为水体环境硝酸盐氮污染源的判定依据。

质谱法是稳定同位素分析中最通用、最精确的方法。水中硝酸盐氮稳定同位素比值测定一般包括以下两个步骤：通过反硝化细菌法[15]或者化学方法[16-17]将水中微量硝酸盐转化为N2O气体，然后用带自动预浓缩装置的同位素比值质谱仪测定N2O中的氮稳定同位素比值。其中，细菌反硝化法存在一定的缺陷，实验所需的反硝化细菌需要专门培养，培养条件较高，整个反硝化过程中N2O气体的收集与储存对实验仪器和实验技能要求较高，因此，国内应用此方法的很少；相对于反硝化细菌法，化学转化法对实验仪器和实验技能要求较低，应用较为广泛[17-19]，但仍存在多点标准曲线难于建立、转化产生N2O气体的质量不便于在操作过程中监控，需完成所有前处理步骤，上机测试后才能确定等问题。近几年，随着光腔衰荡光谱(CRDS)[11-12]、离轴积分腔输出光谱(OA-ICOS)[13]和傅里叶变换红外光谱(FTIR)[14]等检测技术的迅速发展，同位素光谱仪在土壤学、生态学、大气科学等领域开始更广泛的应用。氧化亚氮同位素光谱分析仪是应用激光吸收光谱技术的氮同位素分析仪，其测定过程不受目标气体中同分子量的CO2的影响，能同时测量δ15N、δ17O和δ18O，具有分析成本低，分析速度快等优点。在土壤学或生态学研究中，应用该分析系统通过同步分析N2O稳定同位素(δ15N和δ18O)及N2O浓度和异构体N2O的同位素组成，从而实现快速、直观的反映生态系统中土壤N2O排放特征[20-22]。本文通过化学转化法对不同来源的水中硝酸盐进行前处理，产生的N2O气体导入氧化亚氮同位素光谱分析仪测定氮稳定同位素比值，检验了光谱法在线分析精密度。新建立的方法可为湖泊、河流以及地下水等水体中硝酸盐氮稳定同位素比值高效准确测量提供方法参考，对促进流域环境水体硝酸盐污染源追踪溯源、控制及修复治理方面意义重大。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与装置

Picarro G5131-i(高精度氮氧同位素及气体浓度分析仪)：美国Picarro公司。该仪器使用中红外的光腔衰荡光谱(CRDS)技术，具有时间测量的超高稳定性和超过8 km光程等特性，可实现较高精度N2O气体浓度和δ15N的检测分析。仪器检测浓度范围为300～1 500 nmol/mol，N2O浓度精度<0.05 nmol/mol(1-σ，10 min均值)，δ15N精度<0.7‰(1-σ，300 s均值)。

气体采集及进样装置(作为前端，匹配Picarro G5131-i使用[23])主要由多个PLC控制模块、多个独立电磁阀、多个二通采气阀组等组成。通过自动控制软件控制各种阀的启动及切换，实现多样品在线采集和独立分析测试，全过程均为自动控制。

N2O发生前处理反应瓶容积500 mL(蜀牛)，气密性瓶盖配备密封气垫(Labco，用于注射器等)和采样通道(用于电磁阀控制进样口)及平衡气袋(Tedlar，用于平衡反应瓶内部气压)，具体构造见图1。

1.2 主要材料与试剂

1.2.1标准品 硝酸盐标准品：IAEA-硝酸钾标准品(δ15NAirN2=4.7‰)，购于IAEA国际原子能机构；实验室硝酸钾标准品(δ15NAirN2=-2.8‰)，购于Sigma-Aldrich，纯度≥99.9%，中国科学院亚热带农业生态研究所稳定同位素实验室标定。

图1 N2O发生前处理反应瓶构造Fig.1 Structure of the N2O production bottom

硝酸钾参比溶液：将两种标准样品均配制成10 μmol/mL的参比溶液。

N2O标准气：购于法国液空公司，货号X03NI79C33AC005，浓度1 500 nmol/mol，δ15NAirN2=(2.2±0.3)‰。

N2O工作标准气：委托国家计量科学研究院配制，浓度1 500 nmol/mol，中国科学院亚热带农业生态研究所稳定同位素实验室标定，δ15NAirN2=(-2.3±0.4)‰。

1.2.2前处理试剂 氨基磺酸溶液[c(NH2SO2H)=0.2 mol/L]；醋酸-醋酸钠缓冲液[c(CH3COOH-NaC2H2O2)=1 mol/L]，pH=4.7。镉粒还原剂：镀铜镉粒，北京鹏利驰科技有限公司。以上试剂和药品为优级纯，除特别说明外，均购置于国药集团化学试剂有限公司。

1.2.3待检测水样 JJ1～JJ3分别来自中国科学院亚热带农业生态研究所长沙农业环境监测研究站湘江支流水量及氮磷含量长期监测定位点的地表径流水[24]，样品采集时间为2020年8月16日，水样采集后密封保存于500 mL聚四氟乙烯瓶中并于4 ℃条件下运输至实验室。水样中硝态氮含量用AA3流动注射仪测定(SEAL AA3,Norderstedt,德国)，具体采样点信息见表1。

1.3 实验方法

硝酸盐还原前，预先用氨基磺酸破坏和除去土壤提取液中原有的亚硝酸盐，而铵和其他形态氮均不影响硝酸盐的还原反应。

表1 三种待测水样的信息Table 1 Information of the three types of water samples

1.3.2标准参比溶液及水样中硝态氮-N2O转化 吸取一定量的参比溶液于冷冻干燥机中冻干(24 h)，干粉转移至前处理反应瓶，再分别加入1.0 mL氨基磺酸溶液和50 mg镀铜镉粒于反应瓶，密封反应瓶，用真空泵抽真空后，用注射器加入3.0 mL醋酸-醋酸钠缓冲液后注入高纯空气(保证反应瓶中压力为常压)，将反应瓶放入恒温摇床中(25 ℃)，以120 r·min-1振荡16 h，反应生成N2O气体。上述反应体系中氮含量分别为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、10 μmol，同时做试剂空白，每组重复6次。

取5～10 mL的待检水样于冷冻干燥机中冻干(24 h)，干粉转移至前处理反应瓶中，加入1.0 mL的氨基磺酸溶液和50 mg镀铜镉粒还原剂后振荡5 min去除水样中含有的亚硝酸盐，加盖密封抽真空，加入3.0 mL醋酸-醋酸钠缓冲液，并注入高纯空气。将反应瓶置于恒温摇床中(25 ℃)，以120 r·min-1振荡16 h，反应生成N2O气体。每个样品做3次重复。

1.3.3N2O气体浓度及氮稳定同位素比值测定 将Picarro G5131-i分析仪的进样口(流速20 mL/min)与气体采集及进样装置(前端)连接，同时设置前端的样品采集参数，包括采样和旁路阀切换模式，其中样品采集时间为5 min；旁路(空气)3 min，依次顺序进样，测定完成后自动切换至旁路待机。

待仪器稳定后，将反应瓶的采样通道与仪器进样前端连接，打开采样通道的三通阀，反应瓶中的N2O通过前端化学阱除去大部分的水汽及杂质，进入Picarro G5131-i分析仪内，检测N2O气体中的氮氧稳定同位素比值。检测器测量间隔为10 s，选取进样后3 min内测定值的平均值作为样品的检测结果，每5个样品进行1次标准气校准(N2O工作标准气)。

1.4 数据处理与绘图

使用Excel 2013和SPSS 19.0对实验数据进行处理，使用OriginPro 8软件进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 标准硝酸钾参比溶液的测试

标准硝酸钾参比溶液经过前处理转化生成N2O气体，再结合自动进样前端-Picarro G5131-i分析仪联用系统测定N2O气体浓度及其氮稳定同位素比值，测定的结果示于图2～图3。

图2 不同氮含量下2种标准硝酸钾参比溶液转化产生N2O气体浓度及其产率(柱条代表N2O气体浓度，符号(圆圈和三角)代表产率，数据为平均值，误差棒为SD值，n=6)Fig.2 Concentration and yields of N2O production of two types of KNO3 standard solution relative to the content of N (Bars represent the concentration of N2O, the symbols (circle, triangle) represent N2O yieldData are mean ± standard deviation (n=6))

本研究参考水体中硝酸盐含量，采用0.2～10 μmol共7个浓度梯度的硝酸钾标准品参比溶液进行了前处理，产生的N2O浓度在100～7 000 nmol/mol之间(见图2)，其中1.0～2.5 μmol浓度范围内的实验样品产生的N2O浓度在仪器的最佳检测量程范围(300～1 500 nmol/mol)，而10 μmol参比溶液样品产生的N2O气体浓度超出最高限近4倍。该套前处理反应体系的N2O产率为50%～75%，且随着反应体系氮含量的增加，N2O的产率增加，与曹亚澄等[17]的研究结果基本一致。

图3 光谱法测定标准硝酸钾参比溶液氮同位素比值的准确度与精密度(数据为平均值，误差棒为SD值，n=6)Fig.3 Precision and accuracy of the determination of 15N abundance of two types of KNO3 standard solution relative to the content of N determined by laser spectrum analysis system(Data are mean ± standard deviation, n=6)

标准硝酸钾参比溶液的氮同位素比值测定结果(见图3)显示，在仪器最佳测量范围内的样品均获得了理想的δ15N结果，分别为4.33‰～5.17‰和-2.38‰～-3.18‰，与给定值4.7‰和-2.8‰基本一致(差值小于0.5‰)，前处理(包括冷冻干燥)过程未对样品造成同位素分馏，6次重复测定的标准偏差也小于0.5‰。而超出测定量程的参比样品δ15N值测定的准确度和精密度均较差，重复误差在1.0‰～2.5‰，与标定值偏离超过了2‰，因此，在保证理想的测试准确度和精密度条件下，推荐单次反应体系中氮最低量为0.5 μmol，而最佳范围为1.0～2.5 μmol。

2.2 水样中硝态氮的测试

用经典的稳定同位素质谱法测定样品值作为参考值。根据前处理最佳样品量的要求，取8 mL水样进行冷冻干燥浓缩。浓缩后的水样按照方法要求进行前处理，通过自动进样前端-Picarro G5131-i分析仪联用系统测定其中的氮稳定同位素比值，测定结果见表2。由表2可知，三个采样点水样品的氮同位素比值测试结果较好，数据的标准偏差(n=6)均小于0.5‰，与质谱法测定值的绝对偏差小于0.5‰。

表2 激光光谱仪测定3种未知水样三个重复样中硝态氮的δ15N值(n=6)Table 2 Results of nitrogen isotope of three types of water sample determined by laser spectrum analysis system (n=6)

3 结论

本研究通过一系列实验方法验证，建立了冷冻干燥预浓缩结合化学转化N2O气体的样品前处理方法，并建立了自动进样前端-激光光谱仪联用系统，检测水中硝态氮稳定同位素的测定方法。采用该套分析方法对不同来源水样中的硝态氮进行了氮稳定同位素测试，研究结果表明，该方法的检测限低，仅需要约10 mL的水样，就可获得理想的测试结果，满足常规样品的分析，可为初步判别水体中硝态氮的来源，为水环境污染的预防、控制与治理提供方向。相较传统质谱法分析中涉及的多次样品气低温冷阱预浓缩，测试时长需约30 min，而光谱法操作简单快速，测试时长仅需5 min，不涉及复杂的定量结果校正。此外，稳定同位素比率质谱仪的购置成本和维护成本远高于激光光谱仪。因此，鉴于该方法测试精度高，所用仪器设备自动化程度高、操作简单、维护和测试成本低廉等诸多优点，在水体环境质量的监测和水体硝酸盐污染源追踪溯源等研究中具有广阔的应用前景。