RIPK3介导的程序性坏死在心血管疾病中的研究进展

周刚 吴辉 刘滴 李云曌 张栋

(三峡大学心血管病研究所 宜昌市中心人民医院心血管内科，湖北 宜昌 443003)

心血管疾病(CVD)是导致死亡的最主要原因，具有发病率高且预后不良的特点〔1〕。来自欧洲的一项流行病调查显示，CVD的发病率逐年升高〔2〕。中国心血管健康与疾病报告2019概要中指出我国CVD死亡率也呈现上升趋势，并且位居各种疾病死亡原因首位〔3〕。CVD的发生发展涉及多种细胞死亡形式，包括凋亡、自噬及坏死等。既往研究认为，细胞自噬和凋亡是主动的可调节的细胞死亡方式，而细胞坏死是被动的不受调节的细胞死亡方式。然而，近年来研究发现至少有一部分坏死受信号调节，这种坏死细胞死亡形式同时具有坏死和凋亡的特点，被称为程序性坏死〔4〕。在程序性坏死的发生过程中，受体相互作用激酶(RIPK)1、RIPK3及其底物混合谱系激酶样蛋白(MLKL)是参与细胞程序性坏死的关键分子。许多研究发现RIPK3介导的程序性坏死参与CVD的多个病理生理过程，具有潜在的治疗价值〔5〕。现针对RIPK3分子及其介导的程序性坏死信号通路在CVD中的研究进展进行综述，以进一步了解RIPK3介导的程序性坏死在CVD中的作用，旨在为CVD的防治提供新的靶点及思路。

1 RIPK3及其介导的程序性坏死概述

RIPK3是丝氨酸/苏氨酸受体相互作用蛋白激酶家族的成员，其结构成分包括N端激酶结构域和不同于其他家族成员的C端同型相互作用模序结构域，而不含死亡结构域。激酶结构域是活性区，其中N端激酶结构域在程序性坏死过程中具有重要作用，C端同型相互作用模序结构域可介导RIPK3与RIPK1的相互作用形成RIPK1-RIPK3坏死复合体，随后分别在T357和S358位点磷酸化MLKL，导致MLKL通过N末端结构域易位至细胞质膜和发生寡聚化，最终直接或间接破坏细胞质膜从而导致细胞内炎症因子和免疫复合物直接释放至细胞外，最终招募中性粒细胞、巨噬细胞等聚集激活无菌性炎症反应〔6,7〕。2005年，Degterev等〔4〕发现RIPK1特异性抑制剂坏死抑制素(Nec)-1对细胞的坏死过程具有调控作用，进一步研究发现其细胞坏死过程为一种新的非依赖天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族的程序性细胞死亡，这种细胞死亡形式兼具有坏死的形态学特征和凋亡的程序性，其突出的形态和功能改变为细胞肿胀，细胞质逐渐透明，结构丧失，线粒体广泛破坏，质膜不可逆破裂等，最终导致细胞内容物流出，从而引起显著的炎症反应和邻近细胞损伤〔8〕。与常规细胞坏死的区别在于常规细胞坏死是不可调节的，而这种细胞死亡形式是可被精密的分子机制调节的，遂将其命名为necroptosis，中文译为程序性坏死或坏死性凋亡。目前研究最为广泛的一种细胞坏死类型即为由RIPK3介导的细胞程序性坏死，在调控程序性坏死的过程中RIPK3与多种蛋白激酶分子相互作用形成不同的信号转导通路。除了当前研究较为清楚的RIPK1-RIPK3-MLKL信号传导通路在程序性坏死中发挥重要作用外，Zhang等〔9〕在小鼠动物模型研究中发现了一种新的调控心肌细胞程序性坏死模式，RIPK3通过磷酸化或氧化钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的激活，进一步触发线粒体膜通透性转换孔(mPTP)的开放不仅介导心肌细胞程序性坏死的发生，还同时激活了线粒体途径凋亡发生，即RIPK3-CaMKⅡ-mPTP途径。此外，Zhu等〔10〕研究发现在小鼠缺血再灌注(I/R)模型中I/R损伤可通过RIPK3诱导内质网应激通路介导程序性坏死的发生，进一步研究证实了RIPK3-内质网应激-钙超载-黄嘌呤氧化酶-活性氧簇-mPTP开放信号通路为介导程序性坏死发生的另一条途径。由此可见，RIPK3介导的程序性坏死信号通路复杂多样，其上下游信号通路及靶点尚未完全了解，仍需进一步研究。

2 RIPK3在CVD中的主要作用

心血管系统动态平衡的维持依赖于细胞的死亡和更新。近年来，越来越多的研究表明RIPK3通过介导细胞程序性坏死的发生导致细胞过度丢失与许多CVD的发生发展有关，例如缺血性心脏病(IHD)、动脉粥样硬化(AS)、心力衰竭(HF)等〔11～13〕。因此深入研究RIPK3介导的程序性坏死与CVD的关系，可能会为预防和治疗CVD提供新的理论依据。

2.1RIPK3与IHD 全球每年死于IHD的人数高达900万，是全球范围内高发病率和死亡率的主要原因〔14〕。由于经皮冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路移植术等冠状动脉血运重建治疗技术飞速发展，极大改善了IHD患者的预后，导致短期致死率呈下降趋势，然而由于心肌细胞损伤的不可逆性，大量IHD患者发生心肌梗死(MI)后，会逐渐发展为HF，最终导致长期致死率居高不下〔15〕。因此寻找新的治疗方案以减少MI面积，对维持心室功能及预防HF发生具有重要作用。有研究表明在离体大鼠心脏模型中，使用RIPK1特异性抑制剂(NEC-1或NEC-5)和一些天然产物蒜氨酸，可以产生心脏保护作用减少MI面积，进一步研究发现其部分机制是通过抑制RIPK1-RIPK3-MLKL信号转导通路来减轻缺血诱导的MI面积〔16,17〕。与之一致的是，Luedde等〔18〕探索了RIPK3是否参与MI中的调控，通过建立基因敲除小鼠模型进行实验发现，与野生型小鼠相比，RIPK3基因敲除小鼠在MI后30 d的左室射血分数更高，心肌细胞肥大程度较小，同时炎症反应减弱，活性氧的生成减少。此外RIPK3基因敲除小鼠与野生型小鼠相比MI面积显著降低。揭示了RIPK3在MI中具有极其重要的调控作用，并证实RIPK3介导的程序性坏死加重了小鼠缺血诱导MI后的氧化应激和心脏不良重构。Ghardashi Afousi等〔19〕研究发现高强度间歇训练通过靶向RIPK1-RIPK3-MLKL信号通路，对小鼠MI后的心脏不良重构起到心脏保护作用，进一步验证了RIPK3介导的程序性坏死在MI中的重要调控作用。

MI患者接受开通罪犯血管的再灌注治疗后会引起由快速血流恢复所导致的心肌I/R损伤，研究发现，MI患者接受及时的再灌注治疗后，有50%的心梗面积是由心肌细胞I/R损伤所致〔20〕。因此，积极探索新的干预手段来减轻心肌I/R对于改善MI患者预后具有重要临床意义。一项通过构建衰老小鼠I/R动物模型研究发现，一种具有多种生物学功能的蛋白P62与RIPK1-RIPK3坏死体形成复合物介导程序性坏死的发生，使衰老小鼠心肌细胞更易受I/R损伤。进一步研究发现二甲双胍治疗破坏P62-RIPK1-RIPK3复合物的形成，从而有效抑制了I/R诱导的衰老小鼠心肌细胞程序性坏死的发生，最终降低了该小鼠模型的致死率〔21〕。Zhou等〔22〕探讨了RIPK3在心脏微循环I/R损伤中的作用及其机制，研究发现RIPK3主要由I/R损伤激活，从而加剧内皮细胞程序性坏死的发生，最终导致微血管屏障功能障碍、毛细血管通透性增高和微循环灌注缺陷。在机制上，得出结论是I/R损伤经RIPK3-磷酸甘油酸变位酶(PGAM)5-亲环素(CypD)-mPTP信号通路促进内皮细胞启动程序性坏死导致I/R介导的微血管损伤。进一步的实验发现褪黑素治疗可抑制RIPK3-PGAM5-CypD-mPTP信号通路，从而阻断内皮细胞程序性坏死的发生，减轻心脏微血管I/R损伤。以上研究表明抑制RIPK3相关信号传导途径介导的程序性坏死的发生是减轻I/R损伤的有效方法。因此若能在临床实践中开发具有抑制RIPK3介导程序性坏死发生的临床药物，则可能为减轻心肌I/R损伤提供新的防治策略。

2.2RIPK3与AS AS是心血管系统中一种常见的慢性血管炎症疾病，具有高发病率和高死亡率的流行病学特点，并以AS斑块在大中型动脉的血管壁集聚为特征，一旦不稳定的AS斑块破裂，将会导致血栓形成从而闭塞管腔，引起一系列CVD及其并发症的发生，严重威胁人类健康。尽管药物及介入治疗的飞速发展使AS的治疗取得了一定进展，但AS所引起的心脑血管疾病仍未减少，因此积极探索新的治疗靶点来治疗AS尤为重要。目前越来越多的研究表明RIPK3介导的程序性坏死在AS的发生发展过程中具有重要作用。巨噬细胞程序性坏死的发生被广泛认为是AS斑块形成的关键因素〔23〕。Lin等〔24〕研究发现，与对照组相比，RIPK3基因敲除可以显著降低易患AS小鼠斑块中巨噬细胞程序性坏死的发生，并且RIPK3基因敲除小鼠AS斑块及坏死中心面积显著降低。此外，体外研究表明，RIPK3缺失的巨噬细胞对氧化型低密度脂蛋白诱导的程序性坏死具有抵抗力。该研究证明下调RIPK3表达可以抑制巨噬细胞诱导的AS斑块形成。与之一致的是，Meng等〔25〕研究发现在载脂蛋白(Apo)E基因敲除小鼠的AS斑块中RIPK3被磷酸化修饰，提示该模型小鼠中存在程序性坏死的激活。进一步研究构建ApoE和RIPK3双敲除小鼠模型，发现该组小鼠AS斑块中炎症及程序性坏死水平显著降低。Tian等〔26〕研究发现在具有坏死中心的人AS斑块中，RIPK1和RIPK3的水平显著升高。另外有一项研究表明，与对照组相比，AS患者的颈动脉斑块中RIPK3的mRNA表达显著增加，进一步发现其在不稳定斑块中表达更加显著〔12〕。提示RIPK3的表达上调参与了AS的斑块不稳定性，提前干预RIPK3的表达可能是阻断AS进程的有效策略。肖真真等〔27〕研究发现，与对照组相比，冠状AS心脏病患者血浆中RIPK1、RIPK3、MLKL水平均显著升高，并且进一步研究发现3者水平可能与冠状动脉狭窄严重程度呈正相关。然而，一项研究发现RIPK3在巨噬细胞和内皮细胞中具有AS保护作用，该研究指出RIPK3在AS中的主要作用不是以往描述的促进程序性坏死发生，而是可能通过抑制巨噬细胞中单核细胞趋化蛋白(MCP)-1和内皮细胞中E-选择素的表达发挥抗炎作用，从而在AS中发挥保护作用。并指出造成实验结果差异的原因可能是不同类型的细胞利用促炎成分的方式不同〔28〕。因此RIPK3在斑块的各种细胞类型中的具体作用仍存在争议。

以上研究提示依赖RIPK3的程序性坏死是AS斑块形成的关键驱动因素，RIPK3的水平与斑块的稳定性呈负相关，并且与AS进展的严重程度有密切关系。这种机制为AS的治疗和诊断提供了一种新的思路，提示RIPK3介导的程序性坏死在AS发生发展的过程中扮演了非常重要的角色，通过有效手段降低RIPK3介导的程序性坏死的发生可能是治疗AS的有效方案，患者血浆中RIPK3的水平检测可能对AS的诊断及严重程度评估具有一定的预测价值。

2.3RIPK3与HF HF是一种心脏不能泵出足够的血液来满足组织、器官需要的综合征，继发于左室收缩和舒张功能障碍。由于人口老龄化和危险因素控制不力，HF发病率呈上升趋势〔29〕。虽然当下医学治疗取得了一些进展，但HF患者的预后仍然很差。因此，有必要探索更有效的治疗策略延缓和防止HF的进展。Szobi等〔30〕通过对健康对照组和MI或扩张型心肌病所致终末期HF患者的左心室标本进行研究发现，与对照组相比，HF组中RIPK1和RIPK3的表达水平均显著升高。此外，活化的半胱氨酸蛋白酶(caspase)-8，一种负性调节程序性坏死的促凋亡蛋白酶，在HF组中显著降低。提示在部分HF患者心脏左室中，凋亡的发生可能被抑制而RIPK3介导的程序性坏死是心肌损伤、炎症反应及纤维增生的主要原因。Guo等〔31〕研究发现小鼠心脏特异性肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)2缺失会引发心肌细胞程序性坏死和HF，进一步研究发现，RIPK3基因缺失在很大程度上挽救了由TRAF2缺失引发的心脏表型，证明了RIPK3是TRAF2下游的关键靶蛋白，介导了HF中程序性坏死的发生。既往研究证明了钙调蛋白激酶(CaMK)Ⅱ是RIPK3下游靶蛋白，可共同介导mPTP开放。研究发现，在构建的小鼠模型中，RIPK3基因敲除和CaMKⅡ抑制剂可明显改善I/R或阿霉素治疗所诱导的心肌细胞程序性坏死和HF，进一步实验表明，其部分机制可能是通过阻断RIPK3-CaMKⅡ-mPTP信号转导途径，从而延缓小鼠HF的进程〔9〕。值得注意的是，与心肌细胞不同，促进肌成纤维细胞程序性坏死的发生可能对心脏具有保护作用。已有研究表明，可溶性恒定链(sCD74)/巨噬细胞抑制因子(MIF)通路可通过触发依赖RIPK1-RIPK3的程序性坏死促进肌成纤维细胞死亡，从而发挥抗纤维化作用，最终延缓心脏重构和HF的进程〔32〕。该研究提示，RIPK3介导的程序性坏死在不同类型细胞中其功能具有差异性，其中一些功能在HF的发生发展过程中可能是有益的。因此，探索不同类型细胞间RIPK3介导的程序性坏死的差异作用关系，将有助于阐明以RIPK3为靶点治疗HF的潜在风险和获益。

综上，RIPK3介导的程序性坏死与CVD的发生发展具有密切关系，成为近年来心血管领域的一个新热点。本文讨论了依赖RIPK3的程序性坏死在IHD、AS、HF中的重要作用，因此靶向调控RIPK3可能是治疗多种CVD的有效策略。但目前对RIPK3介导的程序性坏死在CVD中的具体作用和调控机制尚未研究透彻，仍需要更多的相关研究，以期为开发相关分子靶点的药物提供有价值的线索和手段，最终将基于细胞或动物模型实验的发现应用于临床实践。