光生物调节治疗糖尿病周围神经病变的研究进展

龚思淼，李 敏综述，杨 彦审校

0 引 言

糖尿病是世界上最大的代谢疾病之一，在发达国家和发展中国家都具有很高的患病率。截至2021年，全球约有5.37亿成年人患有糖尿病，死亡人数高达约670万人[1]。慢性糖尿病可导致一系列神经、血管并发症，其中最常见的并发症是糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)，通常累及患者感觉、运动及自主神经，患者通常出现麻木、疼痛、痛温觉或触觉异常、神经传导速度下降等症状[2-3]。有数据统计，大约50%的成人糖尿病患者在其一生中会受到周围神经病变的影响[4]，全球每年用于糖尿病的医疗支出目前估计为7600亿美元，预计到2030年将增加到8250亿美元[5]，这对于个人和社会都是巨大的负担。

DPN的发病机制尚未完全明确,目前主要认为是高血糖通过激活旁路代谢或非代谢途径，导致有毒代谢物的积累和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的过度消耗，从而增加线粒体损伤并导致活性氧的过度产生，超出了机体对氧化物质的清除能力，引起氧化应激反应损伤神经组织[6]。此外，活性氧通过激活NF-κB等信号通路引起炎症反应产生疼痛，炎性介质进一步促进下游细胞氧化应激的激活，形成恶性循环加重组织损伤。缓解DPN的氧化应激状态对于延缓DPN的神经损伤至关重要。迄今为止，对于DPN的治疗除了改善血糖，尚无有效的DPN的致病性治疗方法[7]，临床上一般使用营养神经、改善微循环、抗氧化应激药物进行病因及对症治疗[8]，但药物治疗的不良反应与高成本限制了它的广泛应用。光生物调节疗法(photobiomodulation therapy，PBMT)是19世纪末兴起并迅速发展的一种非侵入疗法，因具有无创、无痛、无毒、易获得、抗炎镇痛效果明显、具有良好的抗氧化作用等优势[9]，逐渐被发现并应用到DPN患者的治疗当中。

1 PBMT的应用

PBMT是一种用波长为600～1000 nm的连续激光或发光二极管对病损区域进行照射的治疗方法，可以引起光生物反应而又不会使生物组织产生损伤，也不会导致局部体温升高[10]，又称为 “低能量激光疗法(low-level laser therapy, LLLT)”。PBMT于1967年在匈牙利由Endre Mester发现，他将激光照射到剃光的老鼠背部，发现可以更快地促进毛发生长，随后经过重复试验发现红宝石激光能够促进伤口愈合，于是人们开始将PBMT逐渐应用于临床，比如伤口愈合、预防和治疗口腔溃疡、缓解肌肉骨骼疼痛等方面[11]。

在DPN研究和治疗方面，Anju等[12]人对6项使用PBMT治疗疼痛性DPN研究进行了系统回顾，证实了PBMT的使用对糖尿病神经性疼痛的管理有积极的作用；最近的研究发现用PBM(主要632.8 nm，3.1 J/cm2)照射DPN患者足底和足背10 d后神经性疼痛明显减轻和生活质量改善[13]；一项用904 nm波长GaAs激光照射链脲佐菌素诱导的DPN大鼠的结果显示，DPN大鼠髓鞘结构组织有所改善，纤维损失减少，这种改变可能与氧化应激状态减轻有关[14]；周帆等[15]研究证实：890 nm近红外激光照射治疗能有效改善DPN患者周围神经功能，提高神经传导能力。基于以上研究认为，PBMT利用特定波长的激光与照射区域组织发生相互作用，改善DPN患者的症状，但具体机制有待进一步阐明，现就PBMT近年来在DPN中的临床应用及作用机制进行总结。

2 PBMT对DPN氧化应激的影响

2.1 PBMT对线粒体功能的影响线粒体是糖尿病中活性氧产生的主要来源，超过90%的活性氧在线粒体中产生[16]。高血糖增强了电子传递链的还原当量和穿过线粒体内膜的电化学电位，因此增加了超氧化物(主要是活性氧)的产生，减少了ATP的产生[17]。细胞无法对过量的活性氧进行清除以及ATP产生不足，对线粒体造成损害，引起氧化应激促使细胞死亡和神经变性。此外，高血糖和氧化应激诱导线粒体融合与裂变失衡加剧，过度的线粒体裂变导致能量生产失调，加重背根神经节(dorsal root ganglia，DRG)神经元损伤[18]。改善线粒体的生物功能障碍，促进细胞代谢可能是治疗DPN神经损伤的有效途径。

PBMT主要通过将激光照射到皮肤表面时光能量穿透组织与线粒体内的发色团——细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase，CCO)相互作用，电子被激发并从低能轨道跳到高能轨道，导致线粒体产生ATP增加和电子传输增加。Yamany等[19]认为PBMT通过提高线粒体CCO的活性和增强ATP合成来有效恢复线粒体功能，从而促进照射区域的微循环，增加神经功能活动，增加轴突生长和髓鞘化的速度，促进损伤神经的再生。Oliveira等[20]首次证明PBM(660 nm，30 mW，1.6 J/cm2)能够增加糖尿病小鼠线粒体数量，减轻氧化应激引起的线粒体自噬情况，从而改善细胞代谢状态。Rocha等[21]以成年雄性T1DM大鼠为实验动物，研究了PBMT(904 nm,45 mW,6.23 J/cm2)对线粒体动力学的影响，结果发现PBMT能提高糖尿病大鼠DRG神经元的丝裂霉素2和动力相关蛋白1的表达水平，前者参与线粒体融合，后者参与线粒体裂变。PBMT可能通过恢复DRG神经元线粒体融合和分裂之间的平衡起到保护DRG神经元的作用。

综上，PBMT可通过改善线粒体生物功能，增加ATP的产生，改善微循环等方面减轻氧化应激状态为细胞提供一个合适的营养环境促进代谢。

2.2PBMT对活性氧的影响氧化应激是由活性氧的产生和抗氧化系统之间的不平衡引起的。高血糖通过激活多条代谢通路在线粒体进行整合产生过多的活性氧引起氧化应激反应，最终导致DPN的发生。因此，减少活性氧或者增加抗氧化物质的产生在延缓DPN的发生发展中有重要意义。最近研究发现，当PBM刺激正常健康细胞中的CCO活性时，线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)升高至高于正常基线水平，活性氧生成增加；且存在明显的双相剂量反应，即低水平的激光具有刺激作用，而高水平的激光具有抑制作用。在氧化应激细胞中，PBM同样增加了MMP，但降低了高活性氧水平并保护神经元免于死亡[22]。这种特质为DPN的治疗提供新的研究方向。

Ahemd等[23]用PBM(632.8 nm，6.36 J/cm2)治疗受伤的糖尿病大鼠后，大鼠的抗氧化物质谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平显著升高，炎性细胞因子水平降低。表明PBM通过降低炎症反应、抑制氧化应激和增强抗氧化防御系统来促进伤口愈合。该结果证实了Janzadeh等[24]的推测，PBMT可能通过增加GSH等抗氧化剂水平，改善线粒体和细胞功能，从而降低超敏反应，减轻疼痛。Rajendran等[25]的研究证明660和830 nm的PBM均具有通过增加抗氧化剂超氧化物岐化酶和过氧化氢酶水平、减少活性氧水平和维持正常氧化还原平衡来减弱氧化应激的能力。此外，在相同条件下660 nm波长激光的抗氧化应激效果更好。综上所述，PBMT可以有效减轻氧化应激严重程度，其机制可能与活性氧减少或抗氧化剂水平升高有关。

3 PBMT对炎症反应的影响

当活性氧的数量增加时，细胞会发出信号以重新吸收抗氧化分子。这些信号通路的激活导致转录因子基因上调，导致炎症标志物的募集和产生[26]。这些炎性物质不仅会通过细胞信号转导通路刺激伤害性感受器产生痛觉，还可以促进各种下游细胞氧化应激的激活，引起神经传导速度减慢、神经的血供不足、轴突末梢变性，从而引发细胞的死亡。为了阻止氧化应激的进一步恶化，减少炎性反应是DPN的一种有效治疗方式。PBMT被认为可以通过多种信号通路减轻炎症，已在各种急慢性炎症治疗中显示出积极的效果。

3.1PBMT对巨噬细胞分化的影响PBM的另一个非常有趣的特性是它能够改变巨噬细胞谱系的活化细胞的表型。根据细胞面临的病理情况，这些细胞可以表现出两种截然不同的表型——M1“促炎”表型和M2“抗炎”表型，分别与产生促炎因子和抗炎因子有关[27]。Yang等[28]人研究了808 nm波长激光对两种巨噬细胞极化表型转化的影响，发现与假手术组相比，造模组M1炎性因子标志物表达增加，经过PBM治疗后其炎症水平降低，且M2标志物表达明显增加，表明PBMT可能被用来调节周围神经损伤后的炎症反应，可能机制是将巨噬细胞极化从M1“促炎”表型转变为M2“抗炎”表型。Kobiela等[29]人用808 nm波长激光照射神经损伤小鼠之后，发现IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子的表达降低，进一步研究发现较高的能量密度4-30 J/cm2诱导M1(促炎)表型巨噬细胞的表达，而较低的能量密度(0.2-10 J/cm2)诱导M2(抗炎)表型标记的表达。表明PBMT的抗炎作用可能在低剂量下更明显。

3.2PBMT对NF-κB通路的影响核转录因子NF-κB是氧化应激引起的主要信号通路，在炎症基因转录中起着关键的调节作用[30]。有研究发现持续使用PBMT治疗的受损神经细胞NF-κB和促炎细胞因子减少[31]；另有研究表明，LLLT通过减少活性氧的产生使NF-κB表达减少，从而减轻炎症反应，降低疼痛[32]。Lee等[33]在PBMT治疗人类脂肪干细胞后发现环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphatec，AMP)水平增加了3～4倍，进一步研究发现细胞内cAMP水平的升高抑制了NF-κB的转录活性。调节NF-κB活性的可能机制是cAMP通过促进IκB降解和下调IKK激酶的表达水平，以及改变NF-κB二聚体的组成，从而阻断转录。

3.3PBMT对p38-MAPK的影响巨噬细胞的激活伴随着细胞因子的释放和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)的磷酸化，包括p38-MAPK、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)和c-JunN-末端激酶，它们在多种细胞类型的细胞存活和死亡中都发挥着重要作用,包括参与疼痛超敏反应。Neves等[34]认为PBMT的抗炎机制可能与抑制p38-MAPK途径有关。一项研究PBM对高糖条件下视网膜神经细胞作用的结果显示，PBM可以有效抑制p38磷酸化的增加，从而减弱了氧化应激并提高了细胞存活率[35]。Chu等[36]发现用激光照射人内皮混合细胞系EA.hy926后ERK-MAPK磷酸化增加，p38-MAPK磷酸化降低，为进一步了解PBMT参与MAPK途径的具体机制，用ERK抑制剂处理EA.hy926细胞后，细胞死亡没有增加，而用p38-MAPK激活剂处理后细胞死亡增加，表明PBMT不是通过ERK通路起作用，而是通过抑制p38-MAPK信号通路减少细胞凋亡，起到神经保护作用。以上研究证明，PBMT可通过抑制p38-MAPK通路激活抗炎机制，减少神经的损伤，未来可成为DPN患者的新治疗靶点。

3.4PBMT对PI3K/AKT的影响目前，越来越多的证据表明磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase/serine/threonine protein kinase，PI3K/ AKT)信号通路在活性氧诱导的细胞凋亡中起着至关重要的作用[37]。PI3K/AKT通路在中枢和外周神经元中显示出显著的抗氧化活性，对活性氧诱导的细胞损伤具有保护作用。AKT是一种通过募集到质膜而激活的丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K信号转导的关键介质。PI3K的激活促进AKT的磷酸化，进而影响抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达[38]。氧化应激状态下,Bcl-2活性降低和Bax表达增加，严重影响细胞存活并诱导细胞凋亡，导致神经变性，轴突损伤。Li等[39]的研究表明，PBM(980 nm，250 mW)可能通过激活PI3K改善AKT的磷酸化，调控氧化应激损伤后的Bcl-2蛋白水平上调，Bax蛋白水平下调，促进细胞轴突再生和功能恢复，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。Oliveira等[20]证明PBM增加了神经细胞活力以及通过增加神经突的生长诱导神经发生这种效应是由AKT激活调节的。这些发现为PBM作为周围神经损伤的替代治疗方法提供了充分的实验证据。

3.5PBMT对PKC的影响一项研究显示，PBM可以通过激活PKC信号通路来保护β淀粉样蛋白25-35处理的大鼠嗜铬细胞瘤细胞的凋亡。众所周知，PKC可以通过直接磷酸化Bcl蛋白并改变其与Bax的相互作用来调节其活性，也可以通过激活Raf/MEK/ERK级联来发挥作用[35]。用PBM(632.8nm,1.5mW/cm2)照射大鼠初级皮层星形胶质细胞，可减轻氧化应激，并证实PBM可降低氧化应激的主要因素——细胞溶质磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2，cPLA2)的磷酸化水平和NADPH氧化酶的活性。cPLA2和NADPH氧化酶激活后都可导致线粒体膜电位的降低和活性氧的过度产生，从而增加炎症因子的产生，引起炎症反应。因此，该研究的结果表明，NADPH氧化酶和cPLA2的降低是PBM抗氧化和抗炎作用的机制之一[40]。

综上所述，PBMT可以有效缓解DPN的氧化应激状态，其机制可能是通过调节巨噬细胞的极化、阻断NF-κB转录、抑制p38-MAPK等相关信号通路来下调炎性因子的表达，进而减轻周围神经损伤后的炎症反应，但各相关信号通路参与其中的先后顺序及作用程度有待进一步研究。

4 结 语

DPN作为糖尿病最常见的慢性神经系统并发症，是临床的一大难题。传统药物治疗具有不良反应且成本较高，因此，探索有效且安全的非药物治疗手段迫在眉睫。自Mester发现激光的生物效应之后，研究人员一直将激光用于临床治疗。PBM会导致光化学反应，而ATP的产生会激活一系列下游因子，促进恢复细胞功能、减轻炎症和氧化应激反应、减轻疼痛、增强神经再生和伤口修复。过度的氧化应激导致细胞内信号通路上调，而这些通路被广泛的细胞外信号而被激活。大量试验证明了PBMT对于DPN治疗的有效性和安全性，但目前PBMT作用于DPN的可能作用机制尚不明确。因此，本文通过总结PBM对参与DPN氧化应激的细胞反应的影响的广泛研究后发现，PBM影响和刺激各种细胞类型中的NF-κB、p38-MAPK、PI3K/AKT、PKC等信号通路改善线粒体生物功能，减少活性氧生成、减轻炎症反应，最终改善氧化应激状态。今后需进一步研究特定信号转导途径和这些途径中特定分子的激活是如何通过PBM影响氧化应激过程的，这些研究将进一步推动PBM的发展。

激光的治疗方案目前尚无统一标准，PBMT在治疗过程中出现了相反的结果，这可能归因于研究设计的差异，包括使用不同的波长激光和治疗参数，此外，不同的混杂因素也影响着不同生物学参数的测定。PBMT引起的生物刺激效应依赖波长和计量，不同波长穿透活组织的深度不同，对细胞和组织功能的影响不同。选择合适的波长和治疗参数最大程度改善患者的病变情况是DPN治疗的最终目标。未来还需要进行大量的临床试验，包括使用红光和近红外，以充分利用PBM在DPN中的潜力。此外，通过与人工智能技术的结合，PBMT在DPN中的应用也可以得到提高。机器学习和优化技术以及其他数据驱动和数值建模技术的采用在其他科学和工程领域取得了许多成功。例如，这些技术已成功地应用于最优参数选择和解决复杂的多目标优化问题。然而，这些技术在DPN和PBMT中的应用却鲜有报道。未来的研究可以利用机器学习和优化算法的潜力，探索更广泛的参数范围。这些快速和稳健的计算和建模方法可以帮助确定PBM实施中最优或接近最优的参数组合，达到最佳治疗效果。