ISG15及其介导的ISG修饰在中枢神经系统疾病中的研究进展

彭 铮，庞 骢综述，李 伟，杭春华审校

0 引 言

中枢神经系统是人体结构的“司令部”，与其他系统相比，神经系统解剖复杂，发生疾病往往更为凶险，给患者带来不良预后。如何理解中枢神经系统发生疾病后的病理生理过程，寻找靶点对中枢神经系统疾病进行干预，也是当前的研究热点。

蛋白质翻译后修饰 (protein translational modifications, PTMs) 是指某些功能基团或蛋白质可以添加至靶蛋白上，对靶蛋白功能进行调节，从而增加蛋白质组的功能多样性，比如磷酸化、泛素化、甲基化、乙酰化、脂酰化、乳酸化修饰等[1]，PTMs对细胞的各种生理病理过程都具有重要的调节作用。因此，识别和理解 PTMs在细胞生物学和疾病治疗和预防的研究中至关重要。干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene15,ISG15)是一个类泛素蛋白，可以发挥翻译后修饰作用，虽然泛素化修饰通常导致目标蛋白被降解，但与泛素化修饰不同的是，ISG15修饰对蛋白功能的影响更加复杂多样。ISG15在中枢神经系统中发挥重要的调控作用，对其研究也更有助于对中枢神经系统疾病进行理解，为疾病的干预寻找研究思路。

1 ISG15及其介导的ISG修饰

1.1 ISG15的结构ISG15是一个相对分子质量为15 000～1 7000的蛋白，于1979年被研究人员发现[2]，其结构中具有两个泛素样结构域[3, 4]，可以与蛋白共价结合，通过翻译后修饰发挥生物学作用。其C末端具有亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸(Leucine-Arginine-Leucine-Arginine-Glycine-Glycine, LRLRGG)氨基酸链[5]，含有两个区域(D1、D2)，D1为N端结构域，对应第3～78个氨基酸，D2为C端结构域，对应第79～154个氨基酸[6]，C端和N端均与泛素有大约33%的同源性，此外ISG15与泛素也具有一定的构象相似性[7]。泛素的氨基酸残基赖氨酸29是ISG15的受体，细胞内可以作为ISG15的底物[8]，这说明ISG15也有可能参与到泛素的生物学作用中，但是其机制仍不十分清楚。ISG15在多种哺乳动物及鱼类等脊椎动物均有表达，在不同物种甚至同一物种之间有都具有序列差异性，可能与在三级结构上介导不同的功能有关[9]，然而其LRLRGG氨基酸链在不同物种中具有保守性[4]。

1.2ISG修饰ISG15与泛素具有同源性，与泛素化类似，ISG15修饰底物也需要相关的E1、E2、E3样酶进行作用，而这个过程即为ISG修饰。E1样泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme E1-like, UbE1L,或称为UbA7)是E1样酶，与ISG15的C端结合并参与ISG15的激活，活性位点与泛素E1酶具有45%的同一性[10]，研究人员发现在缺乏UbE1L的小鼠不能形成ISG15偶联物[11]。泛素结合酶E2 L6(ubiquitin conjugating enzyme E2 L6, UbE2L6, 或称为UbCH8)是ISG15的E2样酶，两个课题组的研究人员分别通过对IFN诱导的泛素E2家族酶类筛选[12]、IFN诱导的ISG15结合蛋白进行筛选[13]得出ISG15的E2酶[13]，在泛素E2酶中，泛素结合酶E2L3(ubiquitin-conjugating enzyme E2 L 3, UbE2L3,或称为UbCH7)与UbE2L6在一级序列上具有很高的相似性，泛素E1酶与UbE2L3的亲和力较高，而UbE1L与UbE2L6的亲和力较高[14]，这一差异可能与N末端结构有关，UbE2L6的N端可以与UbE1L特异性结合[4]。E3样酶负责目的蛋白与ISG15的连接，HECT和RLD结构域的 E3 泛素蛋白连接酶5(HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 5, HERC5)是ISG修饰过程中的E3样酶，研究人员发现，小干扰RNA减少HERC5表达可以减少ISG修饰，含有HERC5的过表达可以在无IFN刺激的情况下强烈诱导ISG修饰[15]，HERC5在人中表达，小鼠中无HERC5蛋白，起相似作用的是含有HECT和RLD结构域的 E3 泛素蛋白连接酶6(HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 6, HERC6)[16]。

1.3去ISG修饰ISG15从目标蛋白的解离也需要特定酶类，起这个作用的酶主要是泛素特异性肽酶18(ubiquitin specific peptidase 18,USP18,或称为 UBP43)。1999年研究人员分析AML1-ETO基因敲入小鼠的差异基因时发现这一蛋白，并且发现它属于泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific processing enzyme, UBP)家族[17]，UBP家族酶具有去泛素化的作用，可以将结合在蛋白上的泛素解离[18]。由于其相对分子质量为43 000，因此被命名为UBP43，随后人类UBP蛋白被更名为泛素特异性肽酶(Ubiquitin Specific Peptidase, USP)，根据UBP家族蛋白的发现顺序UBP43又被称为USP18[4]。USP18敲除小鼠显示干扰素诱导ISG修饰增强，但是并没有增强蛋白质泛素化[19]，同时对感染性疾病的抵抗力更强[20]。由于ISG15与泛素具有同源性，具有与泛素相似的结构，因此一些去泛素化酶也具有去ISG修饰的作用[4]，比如USP2、USP5、USP13和USP14等[21]。

2 ISG15及ISG修饰在中枢神经系统感染性疾病中的研究进展

2.1 人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染研究人员发现，艾滋病患者血清及脑脊液ISG15水平均升高[22-23]，高ISG15水平可能与高病毒载量有关，而长期抗逆转录病毒治疗可以降低ISG15的水平。研究表明ISG15可能是HIV相关神经心理学障碍的生物标记物，在HIV导致的神经认知障碍中起到一定作用[22-24]，HIV-1 Tg大鼠是HIV感染的啮齿动物模型，研究人员在大鼠海马中观察到ISG15的高表达以及工作记忆障碍[23]。HIV病毒引起IFN信号通路激活，会诱导ISG15、蛋白53、蛋白21等蛋白的表达，这些蛋白可以激活不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包含蛋白1并抑制dNTP生物合成，从而阻止HIV的复制[25]。

2.2寨卡病毒(zika virus, ZIKV)感染孕妇感染ZIKV会导致婴儿出现脑部畸形。研究人员对巴西18名由寨卡病毒引起的先天性小头畸形儿童进行全基因组甲基化测序，与20名对照组相比，畸形儿童在Rabgap1l、Mx1、Isg15位点发现了显著的甲基化改变。Rabgap1l与神经系统发育有密切关系，而Mx1和Isg15与病毒感染有关，感染寨卡病毒会减弱Mx1和Isg15 CpG岛的甲基化，这可能会导致黏病毒抵抗蛋白1和ISG15蛋白表达水平的升高，从而发挥抗病毒作用[26]。

2.3革兰阴性杆菌感染脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是内毒素的一种。小胶质细胞是中枢神经系统的巨噬细胞[27]，研究人员发现，LPS刺激BV2小胶质细胞系可以引起ISG修饰相关蛋白的表达升高，例如ISG15、UbE1L、UbE2L6、HERC6等，以及蛋白ISG修饰的增加。随后研究人员将UbE1L敲除，发现信号转导子和转录激活子家族1总蛋白水平及磷酸化水平均降低，并且趋化因子配体5和诱导型一氧化氮合酶的水平也有下降[3]。这说明ISG15及ISG修饰可能在小胶质细胞炎性反应中起到了一定的作用。小胶质细胞是脑内的吞噬细胞，M1型具有促炎作用，而M2型则相反。虽然尚无研究表明ISG15在小胶质细胞表型转换中所起的作用，但是ISG15在BV2小胶质细胞中具有抗炎作用是已被证实的[3]，其也有可能通过促进小胶质细胞的表型转换发挥抗炎作用。

2.4其他引起神经系统损伤的感染性疾病在一些其他能够引起神经系统损伤的感染性疾病中，研究人员也观察到了I型干扰素引起的ISG15水平升高及ISG修饰的增加，比如犬瘟热病毒[28]、淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒[29]、圣路易斯脑炎病毒[30]、β诺达病毒[31]等。随着在越来越多感染性疾病中发现ISG15的变化及其所起到的抗感染作用，其作为一个潜在感染标记物也越来越受到关注。

3 ISG15及ISG修饰在神经系统非感染性疾病中的研究进展

3.1 抑郁症抑郁症是一种全球广泛流行的精神疾病，抑郁症患者具有较高的自杀风险，并加重家庭和社会负担[32]。有研究人员收集了23个严重抑郁症(major depressive disorder, MDD)死亡患者的齿状回脑组织，与对照组无抑郁症的死亡患者脑组织进行RNA测序，发现在MDD患者中ISG15表达水平下降。怀孕期间感染病毒或者细菌引起的母体免疫激活(maternalimmuneactivation, MIA)是精神疾病的独立预测因子，有可能导致后代出现抑郁样行为或抑郁症[33]。在妊娠大鼠中模拟MIA状态，研究人员发现子代幼鼠会出现神经树突损坏，ISG15表达增加以及抑郁样行为，而前额叶皮层ISG15过表达也可以出现神经树突损坏和抑郁样行为，抑制ISG15表达则可以改善这些症状。进一步研究发现MIA诱导炎性细胞因子，从而促进ISG15表达，而ISG15则通过抑制神经前体细胞表达的发育下调4/RAS相关蛋白2a通路引起树突损伤，导致抑郁样行为[34]。

3.2共济失调毛细血管扩张症(ataxia telangiectasia, A-T)A-T是一种由于Atm基因缺陷导致的小脑神经退行性疾病。以往研究常集中在Atm对DNA损伤做出的反应[35]，但是新的研究表明Atm可以抑制ISG修饰并促进蛋白酶体介导的蛋白降解。研究人员发现，在A-T患者中，Atm基因突变细胞中的蛋白ISG修饰水平增高，从而导致蛋白酶体介导的蛋白降解受到抑制，而且在Atm敲除小鼠中也观察到了蛋白的ISG修饰增加[36]，A-T受影响的病变组织为小脑，在A-T小鼠小脑中的ISG15水平比大脑中更高(约为3倍)，ISG15水平呈等位基因依赖性变化，Atm-/->Atm-/+>Atm+/+[37]。这说明在A-T患者中，ISG修饰抑制蛋白酶体介导的蛋白质降解，而异常的Atm无法在这个过程中发挥负调节作用，并有可能与患者的神经退行性变有关[36]。此外，当Atm基因突变细胞的蛋白酶体途径受抑制时，会激活自噬。作为蛋白质更新的补偿机制，自噬的过度诱导会导致神经元死亡，而ISG15特异性shRNA可以恢复Atm基因突变细胞的自噬功能[38]。

3.3脑外伤有研究人员在TBI患者脑脊液及动物模型损伤部位也发现了ISG15的升高。研究人员在21日龄和24日龄小鼠中建立脑外伤模型，发现21日龄小鼠的ISG15在发病后72 h达到最高，24日龄小鼠的ISG15在发病后6 h达到最高[39]。ISG15可以修饰肌动蛋白，影响细胞的紧密连接而导致生物屏障的破坏[40]。肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase, MLCK)可将肌球蛋白轻链磷酸化，与肌动蛋白结合，减弱细胞紧密连接[41]，影响血脑屏障通透性。在TBI模型中，MLCK能够增加小鼠的脑水肿[42]。免疫共沉淀显示ISG15和MLCK能够共定位，说明ISG15有可能通过影响MLCK造成小鼠的脑水肿与血脑屏障破坏[39]。在军队中服役的退伍军人被诊断出肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic lateralizing sclerosis, ALS)的风险接近60%[43]，而脑外伤是ALS的危险因素[44]。研究人员发现，在TBI-ALS患者中，脊髓组织的蛋白ISG修饰增高，但在枕叶中并未观察到类似的现象。ISG修饰可能与患者的疾病发生发展相关，而且在TBI-ALS患者脑脊液中也发现了ISG15的增高[45]，这可能与ISG15不仅在胞内表达，也可以作为一个分泌蛋白有关，病变部位释放出ISG15，从而作为一个微环境因子[46]进入脑脊液，发挥调控作用，提示脑脊液中的ISG15有可能作为一个损伤的标记物用于临床非感染性脑部疾病的研究。

3.4脑缺血与脑外伤的研究不同，研究人员在脑缺血模型中发现了ISG15的神经保护作用。在成年小鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型(Middle cerebral artery occlusion, MCAO)中，受损皮层组织的ISG修饰明显升高，游离的ISG15和ISG修饰主要表达于梗塞区域中的神经元和星形胶质细胞，而缺乏ISG15或者UbE1L的小鼠在MCAO中显示更大的梗塞面积[47]。虽然ISG15是一个类泛素因子，但是泛素倾向于结合大分子蛋白质，与缺血后耐受相关，而ISG15更倾向于结合中等分子量蛋白[6]，这暗示了ISG15在缺血性卒中的独特生物作用。

4 结语与展望

ISG15的生物学作用是多样性的，虽然在有一些疾病中能够观察到ISG15的变化以及其可能产生的作用，但如果对其进行干预，是否会引起ISG修饰系统的失衡，从而带来潜在的不利影响，仍不得而知。因此，对ISG修饰的研究，不仅仅要能够观察其生物学作用，而且要补上中间的一环，也即ISG15究竟是修饰到何种蛋白上，从而发挥某种确定的生物学作用。自ISG15发现至今，借助高通量研究技术的发展，已有多种底物被鉴定[48]。对于其底物的研究有助于更完整地理解ISG15及ISG修饰的生物学作用。只有了解其修饰蛋白，对ISG修饰系统的干预才会有更大的概率为疾病的治疗带来获益。