凤仙透骨草抗真菌有效部位化学成分的研究

顾媛媛，陈 媚，王连芝，张洪财，邹迪新

(1.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

凤仙透骨草ImpatiensbalsaminaL.来源于凤仙花科凤仙花属凤仙花的干燥茎，为一年生草本植物，性寒、味甘，微苦，具祛风除湿、活血、消肿止痛之功效[1]。千百年来，中医广泛用于治疗甲沟炎、手足癣等细菌、真菌性疾病，历代本草均有相关记载。为了探寻凤仙透骨草抗真菌作用的药效物质基础，进一步开发利用该资源，本实验在以往的研究基础上[2-3]，继续对凤仙透骨草抗真菌活性部位即乙酸乙酯萃取部位进行深入系统的化学成分分离，得到14个化合物，其中，化合物8～9、13首次从该植物中分离得到的。

1 材料

Bruker-400型超导核磁共振光谱仪(德国Bruker公司)；Waters 2695型分析型HPLC、Waters 2996 APD检测器、LCT Premier XE TOF-MS飞行时间质谱仪(美国Waters公司)；ZF-8D型暗箱四用紫外线分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)；柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂，80～100、200～300目)；薄层色谱用硅胶(青岛海洋化工厂)；C18分析型色谱柱(美国DIKMA公司；5 μm，250 mm×4.6 mm)；密度计(沈阳市卫工玻璃计器厂)；RP-18反相板(德国Merck公司)；柱色谱用反相ODS(ODS-AM，日本YMC公司)；Sephadex LH-20(GE Healthcare Bio-Sciences AB)。HPLC所用溶剂甲醇、乙腈(美国迪马公司，色谱纯)；提取分离试剂均为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司)。

凤仙透骨草于2011年采自黑龙江省兰西县，经黑龙江医药大学药学院中药资源与开发教研室王振月教授鉴定为凤仙花属植物凤仙透骨草ImpatiensbalsaminaL.，凭证标本(编号201107-10)保存于黑龙江中医药大学中医药研究院。

2 提取与分离

将干燥的凤仙透骨草20.0 kg，剪成小块，用95%乙醇溶液加热回流提取3次，每次2 h，滤过，合并提取液，减压回收溶剂至无醇味，得乙醇提取物。将该乙醇提取物用水混悬后，分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇梯度萃取多次，得到乙酸乙酯萃取物246.0 g。该部位经硅胶柱分离，采用二氯甲烷-甲醇(100∶1～15∶1)梯度洗脱，得到6个不同极性段流分Fr.1～Fr.6。Fr.1经硅胶柱，二氯甲烷-甲醇(100∶1)洗脱并重结晶分离得化合物8(11.3 mg)、9(13.1 mg)。Fr.2用二氯甲烷-甲醇(85∶1)洗脱，Sephadex LH-20反相色谱甲醇-水(30∶70)洗脱得化合物1(23.0 mg)、13(9.5 mg)。Fr.3经硅胶柱二氯甲烷-甲醇(70∶1)梯度洗脱，Sephadex LH-20反相色谱甲醇-水(40∶60)分离得化合物3(6.6 mg)、6(10.4 mg)、7(11.0 mg)。Fr.4经硅胶柱二氯甲烷-甲醇(40∶1～0∶1)梯度洗脱，得Fr.4a～Fr.4c 3个亚流分，Fr.4a(40∶1)经制备HPLC甲醇-水(45∶55)分离得化合物2(7.2 mg)，Fr.4b(20∶1)经Sephadex LH-20反相色谱甲醇-水(20∶80)分离得化合物4(6.2 mg)、5(13.0 mg)。Fr.4c(0∶1)经反相中压柱甲醇-水(35∶65)洗脱得化合物10(13.5 mg)。Fr.5经硅胶柱二氯甲烷-甲醇(15∶1)洗脱，反相中压柱甲醇-水(30∶70)梯度洗脱，经制备HPLC甲醇-水(15∶85)洗脱分离得化合物14(14.3 mg)，再经制备HPLC洗脱分离得化合物11(16.7 mg)、12(13.8 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：淡黄色针状结晶(甲醇)，mp182～183 ℃。ESI-MSm/z:211.0[M+Na]+，分子式C11H8O3。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:3.90(3H,s,-OCH3),6.17(1H,s,H-3),7.72(2H,m,H-6,7)，8.11(2H,m,H-5,8);13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:180.0(C-1),160.4(C-2),109.8(C-3),184.8(C-4),126.4(C-5),134.5(C-6),133.3(C-7),123.5(C-8),131.0(C-9),131.9(C-10),56.4(C-11)。以上数据与文献[4]基本一致，故鉴定为2-甲氧基-1,4-萘醌。

化合物2：淡黄色粉状结晶(甲醇)，mp172～173 ℃。ESI-MSm/z:219.1[M+Na]+，分子式C10H12O4。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.58(1H,d,J=15.8 Hz,H-2),6.32(1H,d,J=15.8 Hz,H-3),7.16(1H,d,J=1.9 Hz,H-5),7.05(1H,dd,J=1.9,8.2 Hz,H-9),6.80 (1H,d,J=8.2 Hz,H-8),3.88(3H,s,-OCH3);13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:127.7(C-1),111.6(C-2),149.3(C-3),150.5(C-4),115.9(C-5),124.0(C-6),146.9(C-7),116.4(C-8),170.9(C-9),56.4(C-10)。以上数据与文献[5]基本一致，故鉴定为阿魏酸。

化合物3：淡黄色结晶(甲醇)，mp204～205 ℃。ESI-MSm/z:211.0[M+Na]+，分子式C11H8O3。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.83(1H,d,J=9.4 Hz,H-4),7.09 (1H,s,H-5),6.75 (1H,s,H-8),6.19(1H,d,J=9.4 Hz,H-3),3.89 (3H,s,-OCH3);13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:164.0(C-2),109.9(C-3),147.0(C-4),112.5(C-5),146.1(C-6),152.9(C-7),103.9(C-8),151.4(C-9),112.6(C-10)。以上数据与文献[6]基本一致，故鉴定为东莨菪素。

化合物4：淡黄色粉末(甲醇)，mp276～278 ℃。ESI-MSm/z:287.0[M+H]+，分子式C15H10O6。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.17(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),6.39(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.89(2H,d,J=10.4 Hz,H-3′,5′),8.07(2H,d,J=10.4 Hz,H-2′,6′);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:148.0(C-2),137.1(C-3),177.3(C-4),158.2(C-5),99.2(C-6),16.6(C-7),94.4(C-8),162.5(C-9),104.5(C-10),123.7(C-1′),130.6(C-2′,6′),116.3(C-3′,5′),160.5(C-4′)。以上数据与文献[7]基本一致，故鉴定为山柰酚。

化合物5：白色针状晶体(甲醇)，mp210～212 ℃。ESI-MSm/z:191.0[M+Na]+，分子式C8H8O4。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:3.87(3H,s,3-OCH3),7.55(1H,dd,J=8.7,1.9 Hz,H-6),6.82(1H,d,J=8.7 Hz,H-5),7.53(1H,d,J=1.9 Hz,H-2);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:170.0(CO),152.6(C-4),148.6(C-3),125.2(C-6),123.0(C-5),115.8(C-2),113.7(C-1),56.3(-OCH3)。以上数据与文献[8]基本一致，故鉴定为香草酸。

化合物6：淡黄色针状结晶(甲醇)，mp272～274 ℃，ESI-MSm/z:179.0[M+H]+，分子式C9H6O4。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.16(1H,d,J=9.4 Hz,H-3),7.77(1H,d,J=9.4 Hz,H-4),6.74(1H,s,H-8),6.92(1H,s,H-5);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:164.3(C-2),112.8(C-3),146.0(C-4),113.0(C-5),144.5(C-6),152.0(C-7),103.6(C-8),150.4(C-9),112.4(C-10)。以上数据与文献[9]基本一致，故鉴定为七叶内酯。

化合物7：白色晶体状粉末(甲醇)，mp194～198 ℃，ESI-MSm/z:177.0[M+Na]+，分子式C7H6O4。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.42(1H,d,J=1.9 Hz,H-2),7.40(1H,dd,J=9.6,1.9 Hz,H-6),6.79(1H,d,J=9.6 Hz,H-5);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:170.2(-COOH),151.5(C-4),146.0(C-3),123.9(C-1),123.1(C-6),117.7(C-2),115.7(C-5)。以上数据与文献[10]基本一致，故鉴定为原儿茶酸。

化合物8：白色粉末(甲醇)，mp792～794 ℃，ESI-MSm/z:383.4[M+H]+，分子式C25H50O2。1H-NMR(400 MHz,C5D5N)δ:0.86(3H,t,J=6.7 Hz,-CH3),1.25～1.41(44H,m,22×-CH2),1.79(2H,m),2.51(2H,t,J=7.4 Hz);13C-NMR(100 MHz,C5D5N)δ:176.0(-COOH),29.8(-CH2),14.3(-CH3)。以上数据与文献[11]基本一致，故鉴定为二十五烷酸。

化合物9：白色片状结晶(氯仿)，mp162～166 ℃，ESI-MSm/z:413.4[M+H]+，分子式C29H48O。1H-NMR(400 Hz,CDCl3)δ:5.15(2H,dd,J=8.6,12.8 Hz,H-22,23),5.02(1H,dd,J=8.6,15.1 Hz,H-7),3.59(1H,m,H-3),1.02(3H,d,J=6.6 Hz,21-CH3),0.84(3H,d,J=6.4 Hz,27-CH3),0.78～0.80(9H,3×-CH3),0.54(3H,s,18-CH3);13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:139.5(C-8),138.1(C-22),129.4(C-23),117.4 (C-7),71.0(C-3),55.8(C-17),55.1(C-14),51.2(C-24),49.4(C-9),43.2(C-13),40.8(C-20),40.1(C-5),39.4(C-12),37.9(C-4),37.1(C-1),34.2(C-10),31.8(C-25),31.4(C-2),29.6(C-6),28.5(C-16),25.3(C-28),23.0(C-15),21.5(C-11),21.3(C-21),21.0(C-27),18.9(C-26),13.0 (C-19),12.2 (C-29),12.2(C-18)。以上数据与文献[12]基本一致，故鉴定为α-菠甾醇。

化合物10：黄色针状晶体(甲醇)，mp314～316 ℃，盐酸镁粉反应呈阳性结果，Molish反应阴性，ESI-MSm/z:303.0[M+H]+，分子式C15H10O7。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.17(1H,s,J=2.1 Hz,H-6),6.38(1H,s,J=2.1 Hz,H-8),6.87(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),7.62(1H,dd,J=8.5,2.2 Hz,H-6′)，7.72(1H,d,J=2.2 Hz,H-2′);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:177.3(C-4),165.5(C-7),162.5(C-5),158.2(C-9),148.7(C-4′),147.9(C-2),146.2(C-3′),137.2(C-3),124.1(C-1′),121.6(C-6′),116.2(C-5′),115.9(C-2′),104.5(C-10),99.2(C-6),94.4(C-8)。以上数据与文献[13]基本一致，故鉴定为槲皮素。

化合物11：黄色结晶(氯仿)，mp238～240 ℃，盐酸镁粉反应呈阳性结果，Molish反应阳性，ESI-MSm/z:465.0[M+H]+，分子式C21H20O12。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.20(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.39(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),5.25(1H,d,J=7.5 Hz,H-1″),6.86(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),7.58(1H,dd,J=2.2,8.5 Hz,H-6′),7.70(1H,d,J=2.2 Hz,H-2′)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:159.0(C-2),135.6(C-3),179.5(C-4),163.1(C-5),99.8(C-6),166.0(C-7),94.6(C-8),158.5(C-9),105.7(C-10),123.1(C-1′),117.5(C-2′),145.9(C-3′),149.8(C-4′),116.0(C-5′),123.0(C-6′),104.2(C-1″),75.7(C-2″),78.4(C-3″),71.2(C-4″),78.1(C-5″),62.5(C-6″)。以上数据与文献[14]基本一致，故鉴定为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物12：淡黄色粉末，盐酸镁粉反应呈阳性，Molish反应呈阳性，mp173～175 ℃，ESI-MSm/z:449.0[M+H]+，分子式C21H20O9。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.87(2H,d,J=8.9 Hz,H-3′,5′),8.04(2H,d,J=8.9 Hz,H-2′,H-6′),6.19(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.39(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),5.25(1H,d,J=7.5 Hz)为端基糖质子信号；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)中给出了19个碳信号，δ:159.0(C-2),135.4(C-3),179.5(C-4),163.1(C-5),99.9(C-6),166.0(C-7),94.7(C-8),158.5(C-9),105.7(C-10),122.8(C-1′),117.5(C-2′),145.9(C-3′),149.8(C-4′),116.5(C-5′),122.0(C-6′),104.0 (C-1″),75.7(C-2″),78.4(C-3″),71.3(C-4″),78.0(C-5″),62.6(C-6″)。以上数据与文献[15]基本一致，故鉴定为山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物13：红色油状物，ESI-MSm/z:279.2[M+H]+，分子式C21H20O9。1H-NMR(400 MHz,CDC13)δ:0.97(d,J=6.8 Hz,6H,H-3″,H-4″),0.93(d,J=7.6 Hz,3H,H-4′),7.52(2H,m,J=3.3,5.8 Hz,H-3,H-4),7.71(2H,m,J=3.3,4.4 Hz,H-2,H-5)，4.30(2H,t,J=6.6 Hz,H-1′),4.08(2H,d,J=6.7 Hz,H-1″),2.00～2.06(1H,m,H-2″),1.67～1.74(2H,m,H-2′),1.38～1.46(2H,m,H-3′);13C-NMR(100 MHz,CDC13)δ:132.3(C-1),132.3(C-2),128.8(C-3),130.9(C-4),130.9(C-5),128.8(C-6),167.6(C-1a),167.6(C-2a),71.7(C-1′),27.7(C-2′),19.1(C-3′),19.1(C-4′),65.5(C-1″),29.7(C-2″),30.5(C-3″),13.7(C-4″)。以上数据与文献[16]基本一致，故鉴定为邻苯二甲酸正丁异丁酯。

化合物14：白色固体，溶于甲醇，mp196～198 ℃，Molish反应阳性，异羟肟酸铁反应阳性，ESI-MSm/z:341.1[M+H]+，分子式C15H16O9。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:6.29(1H,d,J=9.2 Hz,H-3),7.82(1H,d,J=9.2 Hz,H-4),7.03(1H,s,H-8),7.20(1H,s,H-5),4.96(1H,d,J=7.5 Hz,H-1′),3.22～3.96归属于葡萄糖上的其他质子信号；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ：163.6(C-2),114.8(C-3),145.6(C-4),113.9(C-5),150.5(C-6),149.6(C-7),105.4(C-8),103.1(C-1′),74.7(C-2′),77.5(C-3′),71.3(C-4′),78.6(C-5′),62.4(C-6′)。以上数据与文献[17]基本一致，故鉴定为七叶苷。

4 讨论

迄今为止，凤仙透骨草化学成分的研究多集中在花及其种子，其茎的化学成分研究则很少[18]。为了寻找其有效成分，进一步开发利用该植物资源，本实验对凤仙透骨草的抗真菌有效部位乙酸乙酯萃取物进行成分研究，从中分离鉴定了14个化合物，包括有机酸、黄酮及萘醌等成分。其中，化合物8～9、13为首次从该植物中分离得到的，在一定程度上丰富凤仙透骨草和凤仙花属植物的化学成分。本研究通过进一步研究凤仙透骨草抗真菌的物质基础，并筛选成分与生物活性的相关性，以期为综合利用该植物资源提供理论依据。