基于网络药理学研究当归挥发油治疗失眠的作用机制

朱丽云，钟 钰，柳小莉，郑 琴*，李文静，任桂林，肖 帅

(1.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004；2.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137；3.西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000)

失眠，又称为“不寐症”，是指患者对睡眠时间和(或)质量不满足并影响其日间社会功能的一种主观体验[1]。据统计，我国目前有3亿的失眠患者，这个数字正逐年增加并趋于年轻化。长期的慢性失眠会导致肥胖[2]、糖尿病、高血压[3-4]、心脑血管[5]等疾病，还会导致焦虑症、抑郁症等精神疾病[6]。目前临床治疗失眠常见的药物有苯二氮卓类和非苯二氮卓类受体激动剂、褪黑素受体激动剂、食欲素受体拮抗剂、抗组胺受体药以及镇静类抗抑郁药[7-8]，长期使用会产生依赖性、宿醉、嗜睡、体质量增加以及第2天眩晕等副作用[9]。尽管失眠现象普遍存在，但发病机制仍未有清晰的定义，因此，寻找新疗法、新方法仍是当下研究的主要方向。

当归始载于《神农本草经》，又名云归、西归、秦归，为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，性温、辛、甘，入肝、心、脾经，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功能[10]。现代药理研究发现，当归挥发油中的藁本内酯通过缓解氯胺酮兴奋中枢的作用，缓解实验动物的躁动不安，具有较强的镇静作用[11]。通过腹腔注射藁本内酯，可显著降低戊巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期，延长睡眠持续时间[12]。然而当归挥发油治疗失眠的机制尚未明确，本研究主要是通过GC-MS分析当归挥发油的主要化学成分，采用网络药理学分析预测当归挥发油治疗失眠的作用机制及物质基础，为当归挥发油防治失眠的机制研究提供理论依据。

1 材料

1.1 药材 当归(产地甘肃岷县，批号20201210)经江西中医药大学药学院刘荣华教授鉴定为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，质量符合2020年版《中国药典》第一部的要求。

1.2 试剂与仪器 无水乙醇(批号2011039)、无水硫酸钠(批号2009032)购自西陇科学股份有限公司，均为分析纯。DZTW控温电热套(北京市永光明医疗仪器有限公司)；HLD-30002型电子天平(杭州友恒称重设备有限公司)；Agilent 7 890 A/5975C型GC-MS仪器(美国安捷伦公司)。

2 方法

2.1 当归挥发油提取 参考文献[13]方法，精密称取当归中药材粗粉100.00 g，装入2 L圆底烧瓶中，加入1 000 mL水，浸泡2 h，提取8 h，收集提取器中的当归挥发油，加入适量的无水硫酸钠，静置、脱水，即得当归挥发油。

2.2 当归挥发油GC-MS分析 气相色谱条件[14]，HP-5MS毛细管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)；进样口温度230 ℃采用程序升温(80 ℃以3 ℃/min升温至167 ℃，保持2.5 min；以2 ℃/min升至202 ℃；以4 ℃/min升至280 ℃，保持15 min)；载气为高纯氦气；体积流量1 mL/min；进样量1 μL。质谱条件，离子源温度230 ℃；电子轰击电离源，电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；四级杆温度150 ℃；扫描范围35～550m/z。

2.3 当归挥发油化学成分鉴定 数据处理采用Data Analysis软件完成。将其阈值调整为16，对当归挥发油化学成分进行筛选。所分辨的质谱在NIST 17.L标准谱库中检索，根据匹配度、保留指数和文献已报道物质进行核对，确定当归挥发油主要活性成分。

2.4 当归挥发油主要活性成分靶点的筛选 通过TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)以及SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库筛选当归挥发油主要活性成分作用靶点。所获得的靶点导入UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)中，靶点名称限定物种为人，规范靶点名称，获得UniProt号。

2.5 失眠潜在作用靶点的筛选 通过Therapeutic Target Datebase数据库(TTD，https://db.idrblab.org/ttd/)、DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca/)、DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/)以及OMIM数据库(https://omim.org/)以“insomnia”作为关键词进行检索失眠相关靶点。删除重复靶点，通过UniProt数据库校正为官方名称。

2.6 当归挥发油成分-失眠靶点网络构建 通过venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在线数据库将获得的当归挥发油成分靶点与失眠疾病靶点取交集，将交集靶点作为潜在靶点，潜在靶点对应的化学成分视为潜在活性成分。将当归挥发油的活性成分和靶点导入Cytoscape 3.7.1软件中，构建当归挥发油活性成分作用靶点的网络图，预测当归挥发油治疗失眠的主要靶点和活性成分。

2.7 蛋白-蛋白互作(PPI)网络的构建 将潜在靶点导入STRING 11.0数据库[15]中，设置Organism为人类“Homosapiens”，以置信度(combined score)≥0.40为筛选标准，PPI结果以tsv格式下载，导入Cytoscape 3.7.1软件，运用Network Analyzer插件对靶点进行运算分析，以拓扑参数度值(degree)大于各节点度值平均数的靶点为关键靶点，绘制PPI网络。

2.8 信号通路与生物过程分析 将潜在靶点导入生物学信息注释数据库[16-17](DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)，Select Identifier选择“official gene symbol”，List Type设置为“gene list”，物种选择为“Homosapiens”，设定阈值P<0.01。对当归挥发油防治失眠的靶点进行geneontology选项下(GO，功能富集分析)生物过程(biology process)和Pathways选项下(KEGG，基因组百科全书)信号通路富集分析，获得当归挥发油与疾病之间的生物过程和信号通路富集分析。利用在线绘图平台ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)将其结果进行可视化。

2.9 靶点-组织分布网络构建 通过The Human Protein Atlas数据库[18]，查找潜在靶点组织分布，下载tsv的格式文件，对数据表达量(NX)大于10的的组织或器官(tissue)进行分析，应用Cytoscape 3.7.1软件构建靶点-组织网络。

3 结果

3.1 当归挥发油的GC-MS分析结果 通过GC-MS分析鉴定出了14个化学成分，如图1所示，相对含量为当归挥发油的99.57%，其中最高的是Ligustilide(81.70%)、trans-beta-Ocimene(7.96%)，见表1。

图1 当归挥发油GC-MS总离子流图

3.2 潜在靶点的筛选 采用TCMSP、Pubchem、SwissTargetPrediction数据库获得的成分靶点，TTD、DrugBank、DisGeNET、OMIM数据库获得的疾病靶点，分别剔除重复靶点，得到144个成分靶点和172个疾病靶点，两者取交集得到41个交集靶点，作为潜在靶点。

3.3 PPI网络分析 如图2所示，包含了38个节点，161条边。运用Cytoscape 3.7.1中Network Analyzer插件对靶点进行运算分析，degree平均值为8.47，degree值表示靶点之间的相互作用，其值越大，节点也越大，表明当归挥发油可能通过作用于这些关键靶点得以在失眠症中发挥作用。根据靶点运算分析结果，SLC6A4的degree值最大，其次是CHRNA4、DRD2、HTR2A等，见表2。

3.4 当归挥发油成分-靶点网络分析结果 如图3所示，有54个节点，其中化合物节点12个，靶点节点41个，126条边，每条边代表当归挥发油成分-疾病靶点之间的相互作用，用degree值表示，节点大小代表degree值大小(红色三角形节点代表当归，绿色V形节点代表化学成分，蓝色圆形节点代表潜在靶点)，degree值越大与节点连接的靶点越多。在网络中，有16个节点的degree值≥ 4.67(平均值)，有效成分节点有9个，见表3。

表1 当归挥发油主要化学成分

图2 核心靶点相互作用网络图

图3 当归挥发油成分-靶点网络图

表2 关键靶点信息

表3 成分-靶点网络图中关键节点成分信息

3.5 GO生物过程分析 使用DAVID数据库进行GO生物富集分析得到104个条目，以条形图展示排名前20的通路，其中包含63个生物过程(BP)条目，25个分子功能(MF)条目和16个细胞组成(CC)条目，见图4。生物过程主要涉及G-蛋白偶联受体信号通路(G-protein coupled receptor signaling pathway)、氯离子跨膜转运(chloride transmembrane transport)、γ-氨基丁酸信号通路(gamma-aminobutyric acid signaling pathway)、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路(adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway)、细胞增殖(cell proliferation)等；分子功能主要涉及质膜(plasma membrane)、突触后膜(postsynaptic membrane)、神经元细胞体(neuronal cell body)、GABA-A 受体复合物(GABA-A receptor complex)、氯离子通道复合体(chloride channel complex)等；细胞组成主要涉及细胞外配体门控离子通道活性(extracellular ligand-gated ion channel activity)、GABA-A受体活性(GABA-A receptor activity)、G蛋白偶联乙酰胆碱受体活性(G-protein coupled acetylcholine receptor activity)、肾上腺素结合(epinephrine binding)、苯二氮卓受体活性(benzodiazepine receptor activity)等。

3.6 KEGG信号通路分析 使用DAVID数据库进行KEGG信号通路分析得到18条信号通路(P<0.01)，如图5所示，主要涉及神经活动配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、钙离子信号通路(Calcium signaling pathway)、γ-氨基丁酸能突触(GABAergic synapse)、胆碱能突触(Cholinergic synapse)、cGMP-PKG信号通路(cGMP-PKG signaling pathway)、5-羟色胺能突触(Serotonergic synapse)等。

图4 GO富集分析

图5 KEGG富集通路

3.7 组织-靶点分布图 通过整理分析，共获得2 483条组织数据，对数据表达量NX大于10的组织进行分析，筛选出280条组织(tissue)数据，见图6(绿色圆形节点代表交集靶点，红色菱形节点代表组织或器官靶点，度值越大，节点越大)。结果表明41个潜在靶点分别在基底神经节、大脑皮层、嗅觉、脑桥和髓质、海马等组织中表达。

图6 组织-靶点网络图

4 结论

网络药理学是以系统生物学为基础，通过多学科的交叉应用和整体生物网络的整合与分析，构建药物与疾病作用靶点间的相互作用，阐述中药活性成分间的协同作用，通过“中药-成分-疾病靶点”网络图，探讨药物与疾病间的相互作用，为药物开发与应用提供理论依据[19]。

研究表明，当归挥发油主要是由苯酞类化合物、苯酚类二聚体、萜类、酚类及烷烃化合物为主，其藁本内酯(Ligustilide)含量最高,其次是丁烯基酞内酯[3-Butylisobenzofuran-1(3H)-one][20]。现代药理研究发现[21]，当归挥发油对中枢神经系统具有抑制作用，通过腹腔注射藁本内酯98、196 mg/kg，均能抑制小鼠的自发活动，延长戊巴比妥钠诱导的睡眠持续时间，降低体温，抑制电刺激诱发的激怒反应(P<0.01)。王宇等[22]研究发现，藁本内酯能结合和激动GABAA受体的苯二氮卓类位点，达到镇静、抗焦虑、抗癫痫的作用。丁烯基酞内酯是当归挥发油中苯酞类活性成分，研究发现其不仅是有效的5-HT和去甲肾上腺素再摄取的抑制剂，而且对单氨氧化酶具有一定的抑制作用[23]。Deng等[24]发现苯酞类二聚体化合物Riligustilide、Gelispirolide与GABA受体具有较号的结合能力，这表明苯酞类化合物具有防治失眠的潜力。

通过GC-MS结果分析显示，当归挥发油主要包含Ligustilide、trans-beta-Ocimene、Z-Butylidenephthalide等14种活性成分，对当归挥发油进行检索和筛选，获得14种成分对应144个靶点。通过PPI网络分析表明，当归挥发油中SLC6A4、CHRNA4、DRD2、HTR2A、CHRM1等靶点治疗失眠的可能性较大。SLC6A4、HTR2A是色氨酸途径中的关键调控基因，维持5-HT的稳态[25]。CHRNA4是神经元nAChR的主要基因，其突变可能与神经系统疾病有关[26]。DRD2广泛存在于中枢神经系统中，是最重要的多巴胺自身受体[27]。综上所述，当归挥发油中的关键靶点可能是通过调节神经系统内稳态，从而防治失眠，间接证明网络药理学是预测成分靶点的有力工具。

核心靶点与组织分布结果表明，41个潜在靶点在神经递质中高表达。KEGG结果显示，当归挥发油治疗失眠潜在作用靶点主要涉及G-蛋白偶联受体信号通路、氯离子跨膜转运、γ-氨基丁酸信号通路等生物过程，主要涉及细胞外配体门控离子通道活性、GABA-A受体活性、G蛋白偶联乙酰胆碱受体活性等分子功能，主要涉及质膜、神经元细胞体、GABAA受体复合物等细胞组成。主要与神经活动配体-受体相互作用、钙信号通路、γ-氨基丁酸能突触、胆碱能突触、cGMP-PKG信号通路、5-羟色胺能突触等通路有关。当归挥发油的活性成分主要与以上生物过程、分子功能、细胞组成以及信号通路达到治疗失眠症的目的。

综上所述，当归挥发油治疗失眠的作用靶点，分布于不同的代谢通路，多成分、多靶点以及多通路的相互作用是治疗失眠症的特点。研究结果初步验证了当归挥发油的作用机制和基础药理学作用，为进一步研究探讨作用机制提供了理论依据及研究方向。