荷叶化学成分的研究

高利兴， 王丽明， 运乃茹， 隋洪飞， 韩立峰*

(1.天津中医药大学第二附属医院，天津 300150；2.天津中医药大学，天津 301617)

荷叶为睡莲科莲属植物莲NelumbonuciferaGaertn.的干燥叶，具有清暑化湿、升发清阳、凉血止血之功效，主要用于治疗暑热烦渴、暑湿泄泻、脾虚泄泻、血热吐衄、便血崩漏等症[1]。现代医学研究表明荷叶在降压、降脂等方面功效显著，由于其为药食同源的药材，所以众多减肥降脂保健品均含有荷叶。荷叶中含有的化学成分主要有生物碱、黄酮、降倍半萜、挥发油、有机酸等[2-4]。为进一步阐明荷叶的药效物质基础，为创新药物和保健品的研究与开发提供科学依据，对荷叶的化学成分进行了分离纯化研究，从该植物的70%乙醇提取物中分离得到9个化合物，其中化合物1～4、6～9为首次从莲属植物中分离得到。

1 材料

Bruker AV 400及500 M超导核磁共振波谱仪，内标为TMS(瑞士Bruker公司)；Agilent 6520系列质谱仪(美国Agilent公司)；DLSB-25 L真空循环水泵 (巩义市予华仪器有限责任公司)；RE-52 A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；VOS-301SD真空干燥箱(日本EYELA公司)；柱色谱硅胶(青岛海洋化工有限公司)；柱色谱ODS填料(日本YMC公司，50 μm)。分析纯二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇及色谱纯甲醇等有机溶剂(江苏汉邦科技有限公司)；分析纯氯仿、丙酮(新疆乌鲁木齐飞跃试剂有限责任公司)。

荷叶药材购买于安徽亳州中药饮片厂，经天津中医药大学第二附属医院药学部胡永健专家鉴定为睡莲科植物莲NelumbonuciferaGaertn.的干燥叶，植物标本存放于天津中医药大学第二附属医院药学部标本室。

2 提取与分离

干燥荷叶药材5 kg，用70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，过滤，减压浓缩，真空干燥，得干膏550 g。取500 g干膏加1 000 mL水悬浮，分别用等体积的二氯甲烷、乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取，每种溶剂萃取3次，合并各萃取层，减压浓缩，真空干燥。

对二氯甲烷萃取物(80 g)进行硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮(100∶0～0∶100)梯度洗脱，薄层检识，合并相同流分，共得到14个流分(Fr.C1～Fr.C14)。取Fr.C6(2.1 g)，经ODS柱色谱，用甲醇-水(50%～100%)梯度洗脱，共得到14个流分(Fr.C6.1～Fr.C6.14)，Fr.C6.2经制备HPLC，55%甲醇分离，得化合物3(14 mg)，Fr.C6.4经Sephadex LH-20柱色谱，甲醇洗脱，得化合物2(16 mg)；Fr.C8(5.1 g)经ODS柱色谱，用甲醇-水(30%～100%)梯度洗脱，共得到12个流分(Fr.C8.1～Fr.C8.12)，Fr.C8.9经制备HPLC纯化，32%甲醇洗脱，得化合物4(12 mg)；Fr.C11(1.1 g)经ODS柱色谱，用甲醇-水(40%～100%)梯度洗脱，共得到17个流分(Fr.C11.1～Fr.C11.17)，Fr.C11.9经制备HPLC分离，43%甲醇洗脱，得化合物1(7 mg)。

乙酸乙酯萃取物(100 g)，采用硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇(10∶0～0∶10)梯度洗脱，薄层检识，合并相同流分，得5个组分(Fr.E1～Fr.E5)，Fr.E4(13.5 g)通过ODS柱色谱，依次用甲醇-水(30%～100%)梯度洗脱，共得到8个流分(Fr.E4.1～Fr.E4.8)，Fr.E4.2经Sephadex LH-20柱色谱分离，甲醇洗脱，分别得化合物5(27 mg)、6(36 mg)、9(22 mg)，Fr.E4.3经Sephadex LH-20柱色谱分离，甲醇洗脱，分别得化合物7(21 mg)、8(8 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：桔黄色粉末。TLC板上，紫外灯254 nm下有一很明显的暗斑，用改良碘化铋钾溶液显色呈黄色，推测该化合物可能为生物碱。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)谱的高场区δ：2.69、3.82(each 1H，m，H2-4)与3.54、3.72(each 1H，m，H2-5)，结合1H-1H COSY谱，推断为相邻的2个亚甲基，除此之外，还有一组亚甲基信号δ：3.18(1H，dd，J=14.4，3.6 Hz，H-7)、3.66(1H，d，J=14.4 Hz，H-7)；在高场区还有一个明显的甲基单峰δ：3.46(3H，s，N-CH3)；在低场区有3个单峰δ：5.92(1H，brs)、6.11(1H，brs)和6.60(1H，s，H-3)，结合HSQC谱，分别归属为一个亚甲二氧基(-OCH2O-)和一个孤立的苯环上的氢质子信号(H-3)；此外，还可观察到一组特征峰δ：7.26(1H，td，J=7.6，1.2 Hz，H-9)、7.30(1H，td，J=7.6，1.2 Hz，H-10)、7.32(1H，d，J=7.6 Hz，H-11)、8.06(1H，d，J=7.6 Hz，H-8)，根据偶合常数及化学位移值，可知为邻二取代苯环上相邻的4个氢信号。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)谱结合DEPT谱，知该化合物中有7个季碳，4个仲碳，6个叔碳和1个甲基，在化学位移大于100×10-6的低场区，总共有13个碳，除去1个亚甲二氧基信号δ：101.1，其余为2个苯环上的碳信号δ：143.5(C-1)、117.1(C-1a)、121.2(C-1b)、147.8(C-2)、107.6(C-3)、124.5(C-3a)、133.4(C-7a)、127.0(C-8)、128.0(C-9)、128.5(C-10)、127.4(C-11)、130.3(C-11a)。高场区5个碳信号归属为δ：24.9(C-4)、65.1(C-5)、29.7(C-7)、71.2(C-6a)、58.5(N-CH3)。以上数据与文献[5]报道基本一致，故鉴定为roemerineNα-oxide。

化合物2：棕色粉末。TLC板上，紫外灯254 nm下有一很明显的暗斑，用10%硫酸乙醇溶液显色呈黄色。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)低场区的1组氢信号δ：7.53(2H，d，J=6.4 Hz，H-3′，5′)、7.54(1H，m，H-4′)、7.88(2H，d，J=6.4 Hz，H-2′，6′)提示结构中存在一个单取代的苯环；低场区另存在2个单峰δ：6.66(1H，s，H-3)，6.62(1H，s，H-8)，在高场区有一个甲氧基信号δ：4.05(3H，s，6-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)结合HSQC谱，知该化合物有8个季碳，7个叔碳和1个甲氧基，13C-NMR谱数据归属如下δ：164.1(C-2)、105.3(C-3)、183.0(C-4)、153.3(C-5)、130.4(C-6)、152.1(C-7)、93.4(C-8)、155.2(C-9)、105.9(C-10)、131.3(C-1′)、126.3(C-2′，6′)、129.1(C-3′，5′)、131.9(C-4′)、60.9(6-OCH3)。以上数据与文献[6]报道基本一致，故鉴定为千叶纸素-A。

化合物3：淡黄色粉末。TLC板上，紫外灯254 nm下有一暗斑，用10%硫酸乙醇溶液显色呈黄色。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)谱低场区的1组氢信号δ：7.62(2H，d，J=7.2 Hz，H-3′，5′)、7.63(1H，m，H-4′)、8.08(2H，dd，J=7.2，2.0 Hz，H-2′，6′)提示结构中同样存在一个单取代的苯环；低场区另存在2个单峰δ：7.00(1H，s，H-3)，6.32(1H，s，H-6)，在高场区有1个甲氧基信号δ：3.86(3H，s，8-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)结合HSQC谱知有8个季碳信号，7个叔碳信号和1个甲氧基信号，13C-NMR谱数据归属如下δ：162.9(C-2)、105.0(C-3)、181.9(C-4)、156.2(C-5)、99.1(C-6)、157.4(C-7)、127.7(C-8)、149.5(C-9)、103.6(C-10)、130.8(C-1′)、126.2(C-2′，6′)、129.2(C-3′，5′)、132.0(C-4′)、60.9(8-OCH3)。以上数据与文献[6]报道基本一致，故鉴定为汉黄芩素。

化合物4：黄色粉末。TLC板上，紫外灯254 nm下有一很明显的暗斑，用体积分数为10%的硫酸乙醇溶液显色呈淡黄色。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)低场区可以观测到3组氢信号δ：7.11(1H，s，H-2)、6.79(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)、7.02(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)提示结构中存在一个ABX自旋耦合系统的苯环；δ：7.05(2H，d，J=7.6 Hz，H-2′，6′)、6.72(2H，d，J=7.6 Hz，H-3′，5′)提示结构中还存在AA’BB’自旋耦合系统的苯环；δ：7.43(1H，d，J=16.0 Hz，H-7), 6.40(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)提示存在一个反式双键；在高场区有1个甲氧基信号δ：3.88(3H，s，3-OCH3)，以及2个亚甲基信号δ：2.75(2H，t，J=7.6 Hz，H-7′)、δ：3.46(2H，t，J=7.6 Hz，H-8′)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)结合HSQC谱知有6个季碳信号，9个叔碳信号，2个仲碳和1个甲氧基信号，具体13C-NMR谱数据如下δ：128.2(C-1)、111.5(C-2)、149.3(C-3)、149.9(C-4)、116.5(C-5)、123.3(C-6)、142.1(C-7)、118.7(C-8)、169.2(C-9)、131.3(C-1′)、130.8(C-2′，6′)、116.3(C-3′，5′)、156.9(C-4′)、35.8(C-7′)、42.6(C-8′)、56.4(3-OCH3)。以上数据与文献[7]报道基本一致，故鉴定为反-N-(4-羟基苯乙基)-阿魏酸酰胺。

化合物5：白色无定形粉末，易溶于甲醇。在正离子ESI-MS谱中，可以看到准分子离子峰m/z：155.0[M + H]+，推测其分子量为154。在1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)谱低场区，可以看到一组ABX偶合系统芳香氢质子信号δ：6.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)、7.29(1H，dd，J=2.0，8.0 Hz，H-6)、7.34(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)；在13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)谱上出现6个相应的芳香碳信号δ：121.6(C-1)、116.5(C-2)、144.8(C-3)、149.9(C-4)、115.1(C-5)、121.8(C-6)和一个羧基碳信号δ：167.2。以上数据与文献[8]报道基本一致，故鉴定为原儿茶酸。

化合物6：白色无定形粉末，易溶于甲醇。在正离子ESI-MS谱中，给出准分子离子峰m/z：181.1[M + H]+，推测其分子量为180。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)谱显示一组ABX芳香氢质子信号δ：6.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)、6.94(1H, dd,J=1.2，8.0 Hz，H-6)、7.05(1H，d，J=1.2 Hz，H-2)和一组反式烯氢质子信号δ：6.22(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)、7.54(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)；在13C-NMR(100 MHz，CD3OD)谱上出现六个相应的芳香碳信号δ：127.8(C-1)、115.2(C-2)、146.8(C-3)、149.4(C-4)、116.5(C-5)、122.9(C-6)和一组双键碳信号δ：147.1(C-7)、115.5(C-8)，此外，还可观测到一个羧基碳信号δ：171.1(C-9)。以上数据与文献[9]报道基本一致，故鉴定为咖啡酸。

化合物7：棕色油状物。TLC板上，紫外灯254 nm下有一暗斑，用10%硫酸乙醇溶液显色呈淡紫色。高分辨Q-TOF-MS给出其准分子离子峰m/z：181.084 2[M+H]+，确定其分子式C10H12O3。1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)在低场区有3组特征信号δ：7.00(1H，d，J=1.5 Hz，H-2)、6.80(1H，dd，J=2.0，8.0 Hz，H-6)、6.72(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，说明化合物中存在一个1,3,4-三取代的苯环。在中低场区观测到有2组d峰δ：6.42和6.19，计算其偶合常数都为16.0 Hz，知该化合物中含有一个反式双键。在高场区有2组信号，一个是dd峰，为δ：4.08(2H，dd，J=1.5，5.5 Hz),一个是单峰为δ：3.78，根据其化学位移值和峰面积，知前者为亚甲基，后者为甲氧基信号；13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)谱中显示有10个明显的碳信号，在低场区的8个碳信号，结合上面氢谱，知为苯环和反式烯氢的碳信号。再观察HMBC谱δ：129.5(C-7)与δ：7.00(H-2)和6.80(H-6)有耦合，δ：129.0与δ：6.72(H-5)和6.19(H-8)有耦合，则推出δ：129.0为反式双键与苯环的连接处，即为C-1；甲氧基的氢信号δ：3.78与148.2有远程耦合，则知甲氧基连在C-3位上，13C-NMR谱数据归属如下δ：129.0(C-1)、110.3(C-2)、148.2(C-3)、146.7(C-4)、116.0(C-5)、119.9(C-6)、129.5(C-7)、128.0(C-8)、62.2(C-9)、56.1(3-OCH3)。以上数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定为松柏醇。

化合物8：淡黄色粉末。TLC板上，紫外灯254 nm下有一暗斑，用10%硫酸乙醇溶液显色呈紫红色。高分辨Q-TOF-MS(positive and negative)分别给出其准分子离子峰m/z：249.073 5[M+Na]+和225.077 5[M-H]-，确定其分子式C11H14O5。1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)谱的低场区有1个孤立的单峰δ：7.24(2H，s，H-2′，6′)，推测可能为烯氢或苯环上的氢；在中高场区有一明显的单峰δ：3.83(6H，s，3′，5′-OCH3)，根据峰面积知为2个甲氧基信号；在高场区有2个三重峰δ：3.77(2H，t，J=6.0 Hz，H-3)和3.10(2H，t，J=6.0 Hz，H-2)则为饱和碳上的氢信号。13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)谱中总共有8根碳信号，结合高分辨质谱得出的分子式知谱图中有3个重叠信号δ：147.5、106.0和56.0，则推断化合物中有对称结构。从DEPT谱图中可知该化合物中有4个季碳，2个仲碳，2个叔碳，2个甲氧基。通过HSQC谱和HMBC谱，确定了各氢碳之间的对应关系和远程关系。从HMBC谱中可观察到δ：147.5(C-3′,5′)与δ：7.24(H-2′, 6′)、δ3.83(3′, 5′-OCH3)有远程耦合，则知甲氧基连在碳3′和5′上；δ：140.8和127.4分别与δ：7.24都有远程耦合，则推出δ：140.8为C-4′位，且连有一个羟基，而δ：127.4为C-1′位；同时在HMBC谱图上也观察到酮羰基信号δ：197.2与7.24(2H，s， H-2′、 6′)、3.77(2H，t，J=6.0 Hz，H-3)和3.10(2H，t，J=6.0 Hz，H-2)有远程耦合，则推出δ：197.2(C-1)连在C-1′位。13C-NMR谱数据归属如下δ：197.2(C-1)、40.8(C-2)、57.2(C-3)、127.4(C-1′)、106.0(C-2′)、147.5(C-3′)140.8(C-4′)、147.5(C-5′)、106.0(C-6′)、56.0(3′-CH3)、56.0(5′-CH3)。以上数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定为3-hydroxy-1-(3′,5′-dimethoxy-4′-hydroxyphyenyl)propan-1-one。

化合物9：深棕色粉末。TLC板上，紫外灯254 nm下有一暗斑，用10%硫酸乙醇溶液显色呈淡黄色。高分辨Q-TOF-MS给出其准分子离子峰m/z： 181.051 7[M-H]-，确定其分子式C9H10O4。1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)在低场区有三组特征性的信号δ：7.36(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.31(1H，dd，J=2.0，8.5 Hz，H-6)，6.80(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，提示为ABC偶合系统，表明化合物中含有一个1,3,4-三取代的苯环。在中高场区和高场区可观察到另2组特征信号： 4.22(2H，q，J=7.5 Hz，-OCH2)和 1.28(3H，t，J=7.5 Hz，CH3)，知为乙氧基质子信号。13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)结合DEPT谱知有3个季碳信号，1个仲碳信号，4个叔碳信号和1个甲基信号。低场区显示有7个碳信号，其中δ：165.6为酯羰基信号，其余6个为苯环上的碳信号；中高场区的δ：59.9为亚甲基信号，高场区的δ：14.2为甲基信号。13C-NMR谱数据归属如下：δ：120.7(C-1)、116.2(C-2)、145.0(C-3)、150.3(C-4)、115.2(C-5)、121.6(C-6)、165.6(C-7)、59.9(C-8)、14.2(C-9)。以上数据与文献[12-13]报道基本一致，故鉴定为3,4-二羟基苯甲酸乙酯。

4 结论

从荷叶70%乙醇提取物中分离鉴定了9个化合物，化合物1～4、6～9为首次从莲属植物中分离得到。荷叶具有广泛的药理作用，尤其在减肥、降脂方面具有广阔的应用前景，而无论是新药开发还是保健食品的研发都需要对荷叶的物质基础进行系统研究，以期为荷叶资源的深入开发利用提供依据。