产苦马豆素疯草内生真菌及苦马豆素研究进展

莫亚男，郝宝成，杨 珍，梁剑平，段慧荣，尚若锋，王学红，张红娟，刘 宇

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业农村部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州 730050)

疯草(Locoweed)并非植物分类的名词术语，而是国际上对黄芪属、棘豆属与苦马豆属中含有苦马豆素类有毒植物的统称，主要分布于美国西部、亚洲和南美洲的牧区。长期采食疯草会导致牲畜神经功能障碍、繁殖能力降低、生长抑制甚至死亡。疯草是对我国草原畜牧业发展危害最大的一类毒草。疯草的主要毒性物质是疯草内生真菌代谢产生的一种吲哚兹定生物碱苦马豆素(swainsonine，SW)。SW能竞争性抑制甘露糖苷酶活性，引发酶功能障碍和络合物寡糖的积累，从而使不同的细胞特别是神经细胞发生空泡化变性。同时SW通过影响各种糖类、糖蛋白及糖脂的合成以促进肿瘤细胞凋亡，因此SW也是天然的抗癌抗肿瘤药物、具有广阔的临床药用前景。对疯草内生真菌及SW的研究能够为抗肿瘤研究提供充足的SW来源，以及通过内生真菌育种获得无毒疯草，进而从根本上解决动物疯草中毒病以促进我国西部草原畜牧业发展，具有重要意义。本文全面介绍了疯草在中国的种类与分布、疯草与内生真菌互作关系、疯草内生真菌种属及检测方法、疯草内生真菌传播方式与内生真菌育种；SW的来源、毒理机制及生物合成通路最新进展，以期为疯草植株及其内生真菌的改造利用提供理论基础。

1 疯草在中国的种类及分布

疯草主要分布于海拔1 000 m以上干燥半干燥地区，具有抗旱耐寒特性以及强大的生命力，在中国西部草原上蔓延成灾。据统计，中国天然草场总面积为3.97亿hm2，受毒草危害区域有3.33×107hm2。其中疯草面积占毒草危害总区域的33%，对我国危害最严重[1]。目前中国存在47种疯草，包括23种棘豆属、23种黄芪属、1种苦马豆属，其中有13种是严重的草地危害者，主要有甘肃棘豆、黄花棘豆、小花棘豆、冰川棘豆、茎直黄芪、毛瓣棘豆、镰形棘豆等。西藏含有这类疯草10种、青海9种、新疆6种、甘肃11种、宁夏5种，均为受疯草危害最严重的省份；陕西、山西、四川、吉林、辽宁、河北及黑龙江也含有这类疯草1种～4种[2]。畜牧业在我国西部地区的经济发展中占据重要地位，而动物采食疯草中毒直接或间接使我国每年经济损失高达数十亿元人民币。由此可见，对于疯草的治理及改造利用刻不容缓。

2 疯草与内生真菌互作关系

最初人们认为疯草内生真菌存在于植株的所有地上部分包括茎、叶鞘、叶、花及种子，之后汪治刚对老龄黄花棘豆植株的各部位进行检测时发现根中内生真菌分离率为21.33%，茎基部为41.33%，表明疯草根中也存在有内生真菌[3]。疯草种皮中的菌丝含量最高，主要分布于糊粉层，种胚中不含菌丝。在植物组织中，离地面最近的茎基部组织中的菌丝密度最高，其次是叶鞘和叶片，叶柄中最低。疯草内生真菌选择性地侵染组织从而在植株中定植，其原因可能是组织间的营养成分不同或是从种子到植株的过程中内生真菌有部分丢失所致。植物及其内生真菌在长期的进化过程中形成了互利共生关系。疯草植株可提供内生真菌需要的生长物质及稳态环境并通过种子帮助内生真菌进行传播繁殖；此外，内生真菌可提高植株的抗逆性并促进植株生长，其毒性代谢物SW也可避免疯草被动物采食。

疯草生长于干旱半干旱地区，具有抗旱耐寒、强生命力和高繁殖率等特点。在中国，它的覆盖率和年产量远超其他的杂草有很大程度上源于其体内的内生真菌。自然条件下疯草植株的遗传变异也会影响疯草内生真菌在宿主中的定植，He[4]等人通过微卫星标记表征宿主的遗传变异，采用PCR及HPLC检测内生真菌感染率以及SW水平，发现宿主基因型与地理位置、海拔高度及降水量显著相关。当宿主分化时，与共生菌的相互作用减少，在同一个宿主种群中也未能产生可检测的SW。随着海拔梯度的上升，黄花棘豆体内产SW的链格孢属疯草内生真菌数量增加，于海拔3 490 m处达到最高，说明高海拔地区更有利于疯草内生真菌生长，并起到保护植株的作用[5]。共生菌的植株中具有大量多元醇及渗透性调节物质。含内生真菌的植物根冠明显大于不含内生真菌的植物，表明两种植株存在根与地上部分有机质分布的差异。此外，有研究表明黄花棘豆内生真菌AlternariasectionUndifilum可促进拟南芥的生长，主要通过改变拟南芥的根部结构、增加其叶绿素含量、上调生物素上游关键基因表达[6]。含内生真菌的植物具有发达的根系和极强的抗旱能力，因为其叶片更加卷曲，可以有效地防止水分蒸发和损失。干旱胁迫下被侵染的小花棘豆具有更高的脯氨酸、过氧化物酶、叶绿素、可溶性蛋白及可溶性糖含量，其丙二醛及电导率与无菌植株相比更低，证明了内生真菌提高小花棘豆抗旱能力的作用[7]。夏超发现在干旱条件下内生真菌会通过增加醉马草中脱落酸、吲哚乙酸及磷的含量、生物量及净光合速率，促进醉马草的生长。而且内生真菌可能作为潜在的遗传物质携带者将母本信息通过种子垂直传播至下一代[8]。疯草内生真菌也可提高植株的抗病性，当醉马草内生真菌Epichlo⊇gansuensis与麦角菌同时侵染醉马草时，植株的发病率和病情指数显著降低，主要是内生真菌通过提高植株抗氧化物酶活性、光合作用、激素信号物质及抗病相关代谢物含量，进而提高植物自身的抵抗力以起到较好的抗病保护作用[9]。但当共生体处于某些宿主生境型中，疯草内生真菌与宿主的关系会由共生关系转为寄生关系，对宿主造成消耗。在种子萌发初期，疯草内生真菌的生长会消耗种子内部的营养物质，能量供应减少导致无内生真菌的疯草发芽率、胚芽长及胚根长均高于疯草内生真菌共生体；在温室环境中，共生体3个月幼苗的生物量也显著低于无菌幼苗[10-11]。

3 疯草内生真菌种属及检测方法

疯草内生真菌种属的划分归类自其被分离出后几度产生更改，疯草内生真菌最初被划分为链格孢属(Alternariaspp)，而后根据GenBank中的序列信息将其归属于埃里格孢属(Embellisiaspp)中。当根据波浪状芽管特征的分生孢子建立了波浪状芽管孢属(Undifilumspp)时，原本属于埃里格孢菌属的疯草内生真菌都被划分至Undifilumspp中。后期研究人员用GAPDH、RPB2和TEF1多基因构建进化树并根据多基因遗传进化分析，将Undifilum及Embellisiaastragali再次划分至链格孢属中，成为链格孢属波浪状芽管孢组[12-13]。Martinez利用真菌分离培养和PCR技术对南美几种报道含有SW的巴塔哥尼亚黄芪属植物进行内生真菌的检测,从Astragaluspehuenches及A.illinii的种子中分离到1株共生内生真菌。分离到的共生菌在体外均产SW，通过核糖体DNA分析，证明该菌属于AlternariasectionUndifilum。AlternariasectionUndifilum极有可能与其他报道含有SW的南美黄芪属植物有关联[14]。王维夫等人采集了内蒙古不同种群中的小花棘豆，从其中分离培养出的内生真菌经5.8S rDNA/ITS序列比对鉴定为Alternaria，并证明了该菌是小花棘豆含SW的唯一原因[15]。

疯草内生真菌的检测是探索其在疯草植株内的分布情况与传播方式等的重要手段。从传统的菌丝体染色法、分离培养到目前的分子生物技术如聚合酶链式反应(PCR)都被广泛应用于疯草内生真菌的检测。苯胺蓝染色法用于观察菌丝，虽然操作简便，但是并不具有特异性。疯草内生真菌分离培养法主要通过观察真菌体外培养特性及其显微形态来检测与鉴定疯草内生真菌，但该法周期长且易受到环境因素干扰而不能准确鉴定真菌种类。因此，科研人员期待找出更快速、准确的方法用于检测及鉴定疯草内生真菌。

传统的PCR检测法使用的引物是国际通用疯草内生真菌引物OR1/ITS5，但该引物特异性不强。之后陈丽[16]建立了多基因PCR检测法，可通过当家基因、生物碱合成基因以及育性基因对醉马草内生真菌进行检测与鉴定，该方法不仅可判定内生真菌存在与否，也可确定其类别、育性交配类型及共生体生物碱的类型，也为后续设计具有特异性的引物提供了思路。2016年刘建利设计出比OR1/ITS5特异性更高的疯草内生真菌引物OmtssuF/OmtssuR[17]。2021年时毛彦妮等人又构建了基于疯草内生真菌中的swnK基因KS区域的SYGR Green I实时荧光定量PCR检测方法，该基因为疯草内生真菌中产SW特殊基因，其特异性高于基于ITS序列构建的方法，灵敏性也较高，内生真菌DNA的最低检出限为0.009 ng/μL，可定量分析疯草中内生真菌含量[18]。

4 疯草内生真菌的传播与繁育

疯草内生真菌在疯草中的传播方式主要是垂直传播，但是疯草种子带菌率并非100%，且带菌种子长出的植株也未必带菌，可能因为宿主与内生真菌的互利共生关系不稳定以及内生真菌通过种子的过渡不完全。我国的小花棘豆与美国绢毛棘豆存在同源种属的内生真菌，这种情况很难通过疯草内生真菌只存在垂直传播方式进行解释。疯草的茎和叶柄插入PDA培养3个月后会产生大量分生孢子，因此疯草内生真菌也可能存在水平传播方式[11]。如果能够明确疯草内生真菌的传播方式，就可以利用内生真菌育种，通过使改良的内生真菌侵染不带菌的疯草植株，将其改造利用。

目前内生真菌育种取得了较大进展，我国学者采用无菌幼苗接种技术，将Epichlo⊇gansuensis菌株e7080成功转入醉马草中，构建出e7080-醉马草共生体，接种成功率为21%[16]。2021年李春杰等人通过愈伤组织接种法已人工构建出禾草内生真菌(Epichlo⊇bromicola)-大麦的新共生体，新共生体与野生大麦相比其单株种子产量与地上生物量均显著增加。随着现代分子生物学技术、基因工程技术的提高及内生真菌人工接种技术的发展，植物内生真菌将被改造的更为优良，使用内生真菌育种将成为未来的热点[19,20]。通过基因工程改造疯草内生真菌使其成为兼具抗性及无毒特性的菌株，并将之回接至疯草植株中即可获得优良新共生体指日可待，这将为畜牧业的发展做出重要贡献。

5 SW的来源

SW有3种来源，分别是从植物中提取、化学合成及真菌发酵。现阶段人们无法确定存在多少种含SW的植物，由于生长环境、类别、内生真菌数量的不同，其SW含量也存在差异。但由于植物中的SW含量有限，过度收割会对草原生态造成破坏，加之提取过程十分复杂，费时费力，故而该方法不适于大量生产SW。第2种来源是通过化学合成的方法生产SW。由于SW结构中存在手性碳原子，所有的方法都需要先合成SW的前体或中间衍生物，然后通过几个步骤转换为SW。这使得合成难度增大且合成过程中会产生大量难以分离的手性异构体，给化学合成SW带来了极大的挑战。第3种来源是通过真菌发酵提取SW。豆类丝核菌(R.leguminicola)、金龟子绿僵菌(M.anisopliae)、埃里格孢菌(Embellisiaspp.)以及稻瘟病菌(Magnaporthe)是主要产SW的真菌。现阶段只有波浪状芽管孢组属可以从不同种的疯草中分离得到。真菌发酵具有低成本、条件易控制、环境友好等优势。郝宝成等人于2019年通过紫外辐照、亚硝基胍处理AlternariasectionUndifilumoxytropis获得了SW含量较高的U4、UD1突变株，其产量相比于原始菌株分别增加了16.02%和21.87%[21]。2021年Liang等人通过重离子辐照后成功获得了稳定的A.oxytropis突变体UO1，其SW的产率相较于野生型菌株高了14.84%。通过试验确定了其最佳培养温度为25℃，培养基pH为6.5，最佳接种浓度为每200 mL接种2 mL菌悬液，适当添加生物合成前体L-哌啶酸和L-赖氨酸可以增加SW的合成[22]。当SW的生物合成途径及机理确定之后，可通过基因编辑改造疯草内生真菌，得到高产菌株从而提高SW产量，因此该方法在生物制药领域具有巨大的潜力。

6 SW的毒理学机制

SW具有神经毒性及生殖毒性，会导致牲畜神经功能障碍、繁殖能力降低、生长抑制甚至死亡，其最新毒理学机制研究进展如下。

6.1 神经毒性

SW造成神经症状的主要原因是细胞内α-甘露糖苷酶活性减弱。α-甘露糖苷酶是许多功能性蛋白质糖基化的关键酶，α-甘露糖苷酶活性的抑制将引起寡糖络合物聚集于溶酶体中，糖蛋白合成障碍。此外，SW能够通过死亡受体通路和内质网胁迫诱导脑皮质神经元细胞的凋亡和自噬。然而目前有试验研究表明，SW可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路激活ULK1启动细胞自噬减少细胞凋亡的发生，从而将损伤降低[23]。自噬体与溶酶体融合，但SW能使溶酶体相关表达降低，引起溶酶体功能障碍，导致自噬晚期降解受阻，从而抑制自噬降解，最终引起细胞死亡[24]。故SW引起的神经细胞凋亡与自噬也是其造成神经毒性的原因之一。小鼠围产期时摄入SW将抑制海马齿状回及嗅球神经干细胞的增殖能力，从而减少新生颗粒细胞存活数量，神经元数量改变且颗粒细胞树突复杂程度降低。新生小鼠齿状回早期发育受损，神经元迁移紊乱加之海马中小棘蛋白和NeuN蛋白表达水平降低而影响海马发育，从而造成对神经系统的损害[25]。

6.2 生殖毒性

N-聚糖糖基化修饰对糖蛋白激素的活性具有重要的调控作用[26]。现有研究表明SW通过抑制N-聚糖加工过程中的关键酶(溶酶体α-甘露糖苷酶-Ⅰ、高尔基体-α-甘露糖苷酶-Ⅱ、N-乙酰葡萄糖胺转移酶-Ⅰ及N-乙酰葡萄糖胺转移酶-Ⅱ)活性，改变糖基化修饰、破坏N-聚糖的糖链结构，使杂合型N-聚糖数增多，复合型N聚糖数减少，低聚糖在细胞内蓄积使促性腺激素分泌减少。同时性类固醇激素限速酶及生殖激素受体的表达量降低，因此该类激素分泌降低，与受体结合后活性下降，使其对下游类固醇激素分泌的调控作用失衡，最终导致机体繁殖障碍[27-28]。

7 SW生物合成通路研究

国内外学者针对疯草内生真菌中SW生物合成途径的初始步骤进行了广泛的研究。SW是赖氨酸经过酵母氨酸、哌啶酸、1-哌啶-6-羧酸的代谢产物[29]。目前豆类丝核菌及金龟子绿僵菌的SW生物合成途径已被推导出。在豆类丝核菌中，该过程是从赖氨酸开始进行，途径中会产生一个分支，一条支线是合成SW，另一条支线是合成豆类丝核菌素(SF)。在金龟子绿僵菌中，SW合成的前半部分有两种途径，最终都合成SW的前体物质1-哌啶-6-羧酸(P6C)，然后再生成SW。但是氧化链格孢菌中的SW生物合成途径中的类似步骤尚不清楚。

酵母氨酸还原酶(Sac)在氧化链格孢菌的SW代谢中发挥作用，P6C和哌啶酸都是SW合成的前体。王珏等通过构建sac互补株C1 ，发现C1与sac敲除株M1及野生株OW7.8相比SW水平显著提高，可能由于C1中的强启动子使sac过表达，从而促进了C1SW的生成，也证明了sac在SW生物合成中的重要作用[30]。之后Li对OW7.8及M1进行的转录组测序分析鉴定了41个可能与SW生物合成相关的基因，推测SW在真菌中的生物合成途径包括P6C和P2C两个分支[31]。通过对氧化链格孢菌的基因进行测序、注释，发现酵母氨酸脱氢酶(SDH)，酵母氨酸氧化酶(FAP2)，吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)，聚酮合酶(PKS)、细胞色素P450，酵母氨酸还原酶(SR)和甲基哌啶氧化酶(PIPOX)可能在SW生物合成途径中发挥作用[32]。近年来，豆类丝核菌、金龟子绿僵菌、氧化链格孢菌以及印度旋花内生真菌的基因组序列分析显示这类产SW真菌共有的一个直系同源基因簇，被确定为SW合成基因簇(swainsonine biosynthesis gene cluster,SWN)，主要包括swnA、swnR、swnN、swnH1、swnH2和swnK等基因，进一步证实了这些内生真菌中存在相似的SW生物合成途径。其中swnK基因是一个多功能酶编码基因，由A、KS、AT、SDR、SDRe1等多个区域组成，包括预测的腺苷酸和酰基转移酶结构域与其相关的硫醇化结构域，β-酮酰基合酶结构域和两个还原酶结构域，可能在SW生物合成中发挥重要作用。通过使用同源重组敲除绿僵菌中的ΔswnK，使其突变，该突变体不能产生SW，然后用野生型基因补充了突变体后能重新建立SW的生物合成，从而证明了swnK的作用[33]。其他的SWN基因群被预测是编码两个推断的羟基酶和两个还原酶，敲除金龟子绿僵菌中的swnR基因后，突变株的SW含量显著降低，说明swnR是关键催化酶基因[34]。郝宝成等利用亚硝基胍诱变AlternariasectionUndifilumoxytropis筛选出D4突变株，并使用高通量测序技术对原始菌株和D4菌株进行全基因组测序，获得D4和原始株相关基因组片段后，注释到产SW的关键基因swnK、swnH2、swnH1、swnR和关键酶预测氨基酸转运蛋白、吡咯啉-5-羧酸还原酶、甲酸/甘油酸脱氢催化酶、酵母氨酸还原酶相似蛋白，并对A.oxytropis的SW生物合成通路进行了最新的预测[21,35]。毛彦妮已将PEG介导的原生质体转化的Split-marker重组技术成功应用于疯草内生真菌，克服了真菌靶向基因替换挑战，并成功构建KS基因敲除盒，该技术是研究疯草内生真菌基因功能的良好选择[36]。目前，SW详细的生物合成路径仍不清楚，科研人员已经获得A.oxytropis中与SW合成相关的一些推测的关键酶的基因序列，并且基因敲除试验有了进一步的突破。相信通过这些关键酶的逐步确定，可以进一步细化SW生物合成的机理，为后续改造疯草内生真菌奠定了基础。

8 展望

疯草营养价值丰富，是一种潜在可利用的牧草资源，同时可以抵御干旱、寒冷和害虫的侵害，能在恶劣的环境中旺盛生长。因此，疯草被视为生态社区特定草地的重要组成部分，特别是当前中国的西部草原环境逐年恶化，对草原的保护刻不容缓。不应该简单地挖除或消灭疯草，而应该对其进行研究和利用。以前的研究专注于疯草内生真菌SW生物合成的性能、内生真菌与其宿主疯草间的关系以及植物的毒理机制。未来针对疯草内生真菌的研究主要集中于两个方面，通过敲除逆向调节酶的基因增加SW产量，能够为研究其在免疫调节、抗癌活性中的作用提供充足的SW来源；另外可以通过敲除假定的前调节酶使疯草内生真菌不产SW，在此基础上通过人工构建获得不含SW的疯草新品种，就能从根本上解决动物疯草中毒病并进行中国西部草地中疯草的综合利用和管理。