针刺在阿尔茨海默病中调控多种类型自噬的机制研究进展

张 菶，杨添淞，李 孟，孙晓伟，冯楚文，孙忠人,3△,周晓卿

1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040;3.黑龙江中医药大学针灸临床神经生物学(脑病)重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150040;4.北京中医药大学深圳医院(龙岗),广东 深圳 518172

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)主要发生于中老年期，以记忆障碍、思维和计算能力障碍甚至人格改变为主要临床表现[1]。虽目前发病机制尚不明确，但该病以细胞外由β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)堆积形成的老年斑(Senile plaques, SP)和细胞内异常磷酸化Tau蛋白积聚形成的神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs)为典型病理表现[2]。自噬(Autophagy)是真核细胞清除衰老受损细胞或细胞器的主要途径, 在维持细胞稳态方面发挥重要作用。自噬按细胞内底物进入溶酶体腔方式的不同可分为大自噬(巨自噬)、小自噬(微自噬)和分子伴侣介导的自噬，按吞噬底物是否具有选择性可分为选择性自噬(包括线粒体自噬、内质网应激、核糖体自噬、高尔基体自噬、铁自噬和脂类自噬等)和非选择性自噬[3]。目前研究表明,在AD发病过程中多种类型的自噬过程均可被激活，它们通过激活相应的下游分子通路，在一定程度上清除AD疾病过程产生的病理产物，继而促进神经功能恢复，但单纯通过该应激反应清除变性或错误折叠蛋白的能力是远不够的。针刺作为传统中医疗法，在临床促进AD患者神经功能恢复方面有一定疗效，同时发现针刺在包括AD在内的多种中枢神经系统疾病中可通过调节神经细胞自噬水平促进神经功能恢复，本研究将对针刺调控AD的自噬机制方面作以综述。

1 巨自噬在AD中的作用以及针刺对该作用的影响

1.1 巨自噬发生过程

巨自噬是目前研究较为深入的自噬类型，其在包括AD在内的多种组织和器官的病理损伤中也较为常见。该过程可大致分为起始阶段、延伸和自噬小体形成阶段、吞噬目的蛋白并降解阶段[4]。

巨自噬起始阶段主要由ULK1-Atg13-FIP2000、Vps34-Vps15-Beclin1两种复合物构成自噬囊泡结构。ULK1-Atg13-FIP2000复合物的形成受复合物雷帕霉素靶蛋白1(Mammalian target of rapamycin 1,mTOR1)和AMP依赖的蛋白激酶[Adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK]共同调控。正常情况下，mTOR1通过磷酸化ULK1上的Ser757位点，从而阻止AMPK对ULK1的磷酸化过程，使ULK1不能与Atg13、FIP2000等蛋白形成复合物，对自噬囊泡的形成发挥负调控作用。反之，在某些因素刺激下，AMPK可通过抑制mTOR1活性，同时磷酸化ULK1上的Ser317等位点激活ULK1，促进其与Atg13、FIP2000形成复合物，继而促进自噬囊泡的形成。Beclin1正常情况下通过与Bcl2结合使细胞自噬水平保持稳定，而某些应激或病理状态下，Beclin1与Bcl2分离，前者随之与Vps34、Vps15等蛋白形成复合物，促进自噬囊泡结构形成[5]。

自噬囊泡通过上述过程不断延展的同时，会将自噬底物包围，直至将其全部包裹形成自噬小体，该过程主要在Atg12-Atg5-Atg16、Atg8/LC3两种复合物的帮助下实现。Atg7和Atg10将Atg12活化后，后者先与Atg5结合形成复合物，随后该复合物再与Atg16结合形成Atg12-Atg5-Atg16复合物，该复合物可结合在自噬囊泡上招募Atg8/LC3。Atg8最早发现于酵母，LC3为其在哺乳动物中的同源物。自噬激活后，LC3在Atg4作用下通过暴露其C末端形成LC3-I，后者又在Atg12-Atg5-Atg16复合物催化下生成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ被招募到自噬囊泡上促进其延展，并最终形成自噬小体，因此LC3-Ⅱ表达水平或LC3-Ⅱ与LC3-I表达比值也是判断自噬活化程度的关键[6]。

自噬小体形成后，会与溶酶体融合形成自噬溶酶体，在溶酶体内多种酸性水解酶作用下将自噬小体内的底物降解，从而完成全部自噬过程。

1.2 巨自噬与AD的关系

1.2.1 巨自噬与Aβ代谢 自噬对于AD后Aβ的代谢是把双刃剑。Aβ是β淀粉样前体蛋白(Aβ precursor protein, APP)裂解生成。APP在神经组织中广泛存在于神经元树突和轴突表面，该蛋白可通过内吞途径进入细胞内，与β分泌酶、γ分泌酶等物质一起包裹于内体，β分泌酶可将APP分解成β-CTF，后者可再被γ分泌酶分解形成Aβ。目前有实验分别在正常小鼠肝细胞、AD大鼠神经细胞中发现自噬囊泡内含有大量APP、β-CTF，上述均为形成Aβ的过程因子，因此可以认为自噬小体是生成Aβ的重要场所。但亦有研究发现，APP以及其降解产物β-CTF和Aβ等均可作为自噬小体的底物被清除，因此巨自噬对于AD后Aβ生成与降解起到双向调控作用[7]。

1.2.2 巨自噬与Tau蛋白代谢 Tau蛋白主要分布于神经元轴突，属微管结合蛋白，其主要作用为促进微管装配。正常情况下，Tau蛋白不会被磷酸化，而AD动物脑组织内可检测到大量磷酸化Tau蛋白表达。目前Tau蛋白磷酸化机制尚不明确，但有关AD疾病模型中自噬水平与Tau蛋白表达的实验表明，3MA等自噬抑制剂可通过阻断磷酸化Tau蛋白降解，进而加速下游病理产物NFTs生成，反之则可使磷酸化Tau蛋白表达明显下降。上述实验从一个侧面说明巨自噬激活可通过抑制Tau蛋白表达对AD发病产生抑制作用[8]。

1.3 针刺在AD中对巨自噬的影响

1.3.1 肾脑相济针刺法在AD中对巨自噬的影响 目前使用该理论指导AD的治疗是最常见的，因为脑与心、肾等脏腑关系密切。脑为元神之府，统领神志及脏腑功能，脑髓来源于肾之精髓，肾精充足上输于脑，才可使人体神志清晰；同时脑与心共主神明，《医学衷中参西录》载:“人之神明有体用，神明之体藏于脑，神明之用出于心”。督脉通过“上贯心”“贯脊属肾”的走行规律，将心、脑和肾三者联系起来，成为广义上的脑，共同发挥元神之府的功用[9]。因此,针刺督脉可发挥贯通心脑肾三脏、调节神志的作用。

AD中医属“痴呆”。许多学者均认为痴呆病位在脑，肾虚是发病根本。武峻艳认为，“气”在肾-督脉-脑系统中通过沟通“精”“神”实现人体的形神合一。禀赋不足、情志内伤和房劳过度等均可使精髓化生不足，是AD发生的主要病机[10]。针刺肾、脑腧穴通过调节肾-督脉-脑系统之气，促进精髓肾脑相关病化生并传输于脑，是治疗痴呆的主要理论基础。高杨[11]认为，“肾气亏虚、浊瘀蒙窍”是AD的主要中医病机，AD的病理产物Aβ和Tau蛋白等应属内生痰浊瘀血。

郑清[12]在电针通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路对AD大鼠学习记忆认知障碍与自噬水平的相关性实验中通过同时针刺百会穴、肾俞穴发现，该针法可通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路，继而激活大鼠海马区神经细胞巨自噬水平，从而清除NFTs，促进AD大鼠学习记忆认知功能。有学者通过针刺相同穴位发现，该针刺法通过抑制GSK3β/mTOR通路改善AD大鼠记忆障碍，这可能通过mTOR下调激活海马区神经细胞巨自噬水平，继而促进AD相关病理产物降解有关[13]。

孙赫楠等[14]通过针刺AD患者百会、涌泉穴发现，该针刺法可明显下调AD病理损伤主要产物Aβ水平。但肾脑相济针刺理论是否通过调控自噬达到此目的？高杨[11]通过构建大鼠AD模型，并同样选取上述穴位作为干预方法，通过观察大鼠海马区和颞叶皮质区神经细胞发现，针刺下调Aβ机制与上调自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和抑制p62表达有关。

1.3.2 调督启神针法在AD中对巨自噬的影响 督脉与脑密切相关，在循行上督脉入络脑，因此临床上单纯以督脉穴为主穴对AD后神经功能恢复也有较大帮助。

赵盼盼[15]通过针刺AD大鼠百会穴、迎香穴观察该针刺法对大鼠神经功能缺损的影响以及该针刺法通过调节神经细胞自噬在这一过程中发挥的作用中发现，针刺可通过激活AD大鼠海马区神经细胞自噬水平改善大鼠空间记忆功能，这可能与自噬激活后促进AD病理产物Syn降解有关。而孔莹等[16]单纯针刺AD模型大鼠督脉百会穴观察其对自噬相关蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ表达影响时发现，针刺百会穴可明显上调上述两种蛋白表达，说明该针刺法可激活AD后神经细胞自噬水平。

1.3.3 其他针法在AD中对巨自噬的影响 张玉杰[17]通过针刺AD大鼠四关穴观察大鼠脑组织海马区自噬相关蛋白LC3、p62，以及AD病理损伤相关蛋白Aβ和Tau表达发现，针刺可明显上调自噬相关蛋白LC3表达，同时可抑制Aβ和Tau蛋白表达。因此可证实，针刺四关穴可通过激活AD大鼠脑组织海马区神经细胞巨自噬来降解Aβ、Tau蛋白，继而促进神经功能恢复。

2 分子伴侣介导自噬在AD中的作用以及针刺对该作用的影响

分子伴侣是在细胞内帮助其他蛋白质进行正常折叠、组装和降解的一类蛋白质，近年发现，该家族的某些蛋白可作为分子伴侣参与自噬过程，因此该方式被称为分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autopgagy, CMA)[18]。CMA仅存在于哺乳动物，由分子伴侣HSC70识别带有KFERQ序列的蛋白作为底物，并将后者运送到溶酶体内进行降解，因此该种自噬类型属于选择性自噬。

CMA可参与包括亨廷顿病、AD以及帕金森病在内的多种神经系统退行性疾病过程。在AD发病中，通过分子伴侣选择性识别突变的Tau蛋白，进而将后者运输到溶酶体内降解成多肽，可有效抑制AD进展。

但目前尚无有关针刺通过调节CMA机制抑制AD后磷酸化Tau蛋白或Aβ的文献，因此未来可将该研究作为突破口观察针刺促进AD后神经功能恢复的可能机制。

3 内质网应激在AD中的作用以及针刺对该作用的影响

3.1 内质网应激发生过程

内质网(Endoplasmic reticulum, ER)是哺乳动物胞质内重要细胞器，其主要功能是参与蛋白质折叠修饰以及Ca2+贮存释放。ER是蛋白质形成的场所，而且可敏感地感受到细胞内外环境变化。当ER感受到缺血缺氧、酒精、药物、中毒、感染(细菌、病毒等)及营养缺乏等生理或病理改变后会通过各种应激反应调控其自身稳态，这种改变被称为内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)。在各种ERS中，最典型的就是未折叠蛋白反应(Unfolded protein response, UPR)，该反应通过诱导自噬、减少新生蛋白质合成、增加分子伴侣合成及错误折叠或未折叠蛋白质降解来维持ER内稳态[19]。

UPR过程主要是由分子伴侣葡萄糖调节蛋白78/免疫球蛋白结合蛋白(Glucose-regulated protein78/Binding immunoglobulin protein, GRP78/BiP)和3种感受蛋白：需肌醇酶1 (Inositol-requiring protein 1,IRE1) 、蛋白激酶样内质网激酶(PKR-like ER kinase, PERK)和转录激活因子6(Activatingtranscription factor 6，ATF6)介导的信号通路组成。生理条件下，3种感受蛋白与GRP78/Bip结合而失活。ERS发生后，GRP78/Bip与感受蛋白分离，前者与大量未折叠蛋白结合，使感受蛋白被释放、活化并启动各自的下游信号通路[20]。

以PERK为例，该蛋白在UPR中形成的通路对减少细胞损伤、缓解ER内蛋白质代谢压力有重要作用。ERS发生时，GRP78/BiP和PERK解离，活化的PERK使真核生物翻译起始因子2α(Eukaryotic initiation factor 2α, EIF2α)的Ser51位点磷酸化，弱化蛋白质的合成。转录活化因子4(Activating transcription factor 4，ATF4)作为EIF2α的下游信号因子，激活后能通过诱导Atg12、Atg5及Beclin1表达激活自噬，促进未折叠或错误折叠蛋白质降解，恢复ER稳态[21]。

3.2 内质网应激与AD的关系

AD动物模型脑内神经细胞自噬途径不仅与巨自噬有关，也可能与ERS有关。研究发现ERS与Tau 蛋白间存在相互调控的特点，磷酸化Tau蛋白聚集可诱发ERS，而ERS可通过上调UPR信号诱导Tau蛋白生成增加，因此ERS与Tau蛋白间可能形成恶性循环，介导AD发生。Aβ可导致Ca2+通过ER膜上的Ryanodine受体(Ryanodine receptor,RyR)向胞质和线粒体释放，引起活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平升高，促进细胞凋亡。此外Aβ还可通过激活 PERK/EIF2α/ATF4通路诱导自噬发生[22]。

3.3 针刺在AD中对内质网应激的影响

目前有关针刺通过调节ERS机制抑制AD后磷酸化Tau蛋白或Aβ的文献较少。毛旭等[23]通过针刺AD大鼠百会穴和百会穴左右旁开5mm处的穴位发现，该针刺法可通过抑制大鼠海马CA1区GRP78/BiP蛋白表达来激活UPR下游通路，继而下调Aβ表达，从而抑制神经细胞凋亡。

此外针刺头穴在脑出血[24]、脑缺血再灌注[25]和帕金森病[26]等多种中枢神经系统疾病动物模型中，均可通过激活UPR诱导下游通路促进自噬，达到抑制神经细胞凋亡的目的。而且在心肌再灌注损伤[27]、溃疡性结肠炎[28]和大运动负荷骨骼肌[29]等神经系统以外疾病的组织细胞中，针刺也可通过上述机制发挥作用。

4 线粒体自噬在AD中的作用以及针刺对该作用的影响

4.1 线粒体自噬发生过程

目前诱导线粒体自噬发生的信号通路主要包括Parkin1通路和NIX/BNIP3通路等。以NIX/BNIP3通路为例，NIX/BNIP3蛋白通过在线粒体表面募集自噬小体蛋白LC3，特异性诱导线粒体发生自噬，当受损的线粒体被延展的LC3包绕吞噬后，其后续过程基本与巨自噬相同，通过与溶酶体结合形成自噬溶酶体，以促进受损线粒体降解[30]。

4.2 线粒体自噬与AD的关系

在AD动物模型和患者大脑中，Aβ分布与受疾病影响的大脑区的线粒体膜相关。在APP转基因小鼠模型中发现Aβ似乎被困在线粒体膜中，有人认为Aβ通过在线粒体导入通道中刺激有毒的活性氧物质的异常积累，进而破坏线粒体并影响其功能[31]。

AD模型脑组织中线粒体运输的改变与Tau蛋白磷酸化和异常聚集有关。纤维缠结的神经元显示出比无缠结的神经元更严重的线粒体分布缺陷，表明纤维缠结加剧了线粒体结构和功能障碍。各种不同形式的Tau蛋白均会刺激线粒体，例如磷酸化的Tau蛋白或截短的Tau蛋白会破坏线粒体膜电位，引起氧化应激并促进过氧化物累积以及减弱细胞Ca2+缓冲能力[32]。

4.3 针刺在AD中对线粒体自噬的影响

目前有关针刺通过调节线粒体自噬机制抑制AD后磷酸化Tau蛋白或Aβ的文献较少。李赵龙等[33]应用肾脑相济针刺法，通过针刺AD小鼠百会、肾俞和太溪等穴发现，针刺可通过激活LC3和BNIP3等蛋白表达促进AD神经细胞线粒体自噬，同时结合实验中Aβ表达下调可知，针刺可能通过促进线粒体自噬使细胞内结构和功能异常线粒体含量下降，继而减少Aβ与线粒体酶Aβ结合醇脱氢酶之间相互作用的机会，从而抑制神经细胞内Aβ毒性。

5 讨论

阿尔茨海默病在中医属“痴呆”范畴，临床以行为功能或神志异常为主要特征，目前多认为该病是以各种原因所致的脑髓失养、神机失用为主要病机[34]。现代医学中，虽然AD发病机制尚不清楚，但包括遗传、饮食和激素等多种因素似乎与AD发病均有关联。通过本研究对自噬在AD中的综述可发现，自噬是一把双刃剑，例如在调节病理产物Aβ代谢方面，自噬既可通过包裹并降解形成Aβ的前体物质β分泌酶来促进前者生成，当Aβ生成过多后也可通过形成自噬小体降解的方式将其清除，以调节细胞内蛋白质稳态，表明自噬在AD发病过程中可能是保护因素，也有可能是诱发因素。有关自噬促进Aβ等AD代谢产物的证据较少，但这些结果是否仅是个别现象，是否在实验中有其他因素干预，或该结果的出现是否隐藏其他尚未发现的机制所调控目前尚不得知。但通过目前针刺对AD动物实验的干预发现，针刺对AD后自噬的影响大多是积极的，针刺可通过激活AD后不同自噬类型抑制Aβ和Tau蛋白等AD关键病理产物表达，继而促进神经功能恢复，这些结果为AD的针刺治疗效果提供有力证据，进一步阐明了针刺发挥上述临床疗效的作用机制，同时也为该病的治疗提供新思路。

本研究较全面地对目前主要几种自噬发生机制，以及它们和AD的关系和针刺通过干预上述几种自噬机制在AD中发挥的临床效果作以综述，但因篇幅所限，文章仅对每种自噬的关键机制参与AD发病过程加以阐述，上述机制并非自噬参与AD发病的全部。而且目前有关针刺在AD中通过干预个别种类自噬机制发挥调节神经功能的研究也较少见，因此针刺是否通过干预如分子伴侣介导自噬、内质网应激等机制发挥促进AD后神经功能恢复的作用也只是通过观察针刺在其他类型疾病中干预同种分子机制的实验结果进行推理。以后笔者还将对不同类型自噬机制参与AD发病过程进行逐一探讨。