完全弗氏佐剂诱导慢性炎性痛与焦虑共病的炎症反应特征

孙英舰，张亚民，白文举，姜永莉，郭青娟，张 鹍，刘水冰，王欣赏

(1空军军医大学药学系药理学教研室，陕西 西安 710032； 2空军军医大学唐都医院药剂科，陕西 西安 710038)

国际疼痛学会将疼痛定义为当遭受实际或潜在的组织损伤时一种不愉快的感觉和情绪体验。急性疼痛可以提醒人或动物规避潜在或实际的组织损伤，是一种安全保护机制[1]。慢性疼痛是指持续一个月以上的疼痛，严重影响患者的身心健康和生活质量，已成为临床上难以治愈的重要医学问题[2]。外周组织损伤和持续炎症则是慢性疼痛的重要诱因。临床上，慢性疼痛患者常伴有情感障碍的出现，例如焦虑和抑郁，发病率高达20%～40%[3]。相反，焦虑也会加重患者的疼痛[4]，使慢性疼痛的治疗更加困难。建立稳定的慢性疼痛与焦虑共病动物模型是开发治疗药物和探寻干预靶点的基础。

通过给动物足底注射完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)诱发的慢性炎性痛可持续数周以上，是研究慢性疼痛和痛相关情绪障碍的理想模型[5-7]。旷场和高架十字迷宫实验是检测小鼠焦虑样行为的重要方法，但是CFA诱发的慢性炎性痛模型是否会影响小鼠在旷场和高架十字迷宫中的表现仍存争议性报道[8]，这些研究结果的不同可能与造模后行为检测时间点不同有关。外周和中枢炎症反应产生的炎症因子可引起神经元兴奋性增加，导致中枢敏化，引起疼痛和焦虑症状[9-10]， CFA诱发慢性炎性痛后外周和中枢炎症反应的变化及与焦虑情绪出现的关系有待进一步阐明。本研究拟探究CFA诱发的慢性炎性痛和焦虑样行为以及炎症反应的时间特点。通过足底注射CFA制备小鼠慢性炎性痛模型，观察不同时间点小鼠疼痛和焦虑样行为变化，并检测血清和中枢前扣带皮层(anterior cingulate cortex， ACC)中炎症因子的水平，探讨外周和中枢炎症反应在CFA诱导慢性炎性痛与焦虑共病中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

CFA购自Sigma公司(美国)；ELISA试剂检测盒(Mouse IL-6 ELISA Kit, m1063159V; Mouse TNF-α ELISA Kit, m1002095V; Mouse IL-β ELISA Kit, m1301814V)购自上海酶联公司(中国)；FastKing RTK Kit(with gDnase, KR116)、RealUniversal Color RreMix(SYBR Green, FP201)、RNA Easy Fast Tissue/Cell Kit(DP451)购自TIANGEN公司(中国)。

C57BL/6(8周龄)雄性小鼠购自空军军医大学实验动物中心。饲养条件为12 h光照/12 h黑暗循环，温度22～26 ℃，湿度55%～60%，自由饮水和进食。所有动物实验均经空军军医大学实验动物福利与伦理委员会批准(许可证号：IACUC-20200955)。

1.2 方法

1.2.1 实验方案 将小鼠适应性饲养1周后，随机分为对照组、CFA注射 1 d组、CFA 注射7 d组、CFA 注射14 d组和CFA 注射28 d组。CFA注射组小鼠分别在行为检测前28、14、7、1 d行右后肢足底皮下注射500 mL/L CFA(CFA∶生理盐水=1∶1)10 μL，对照组小鼠在行为检测前28 d注射等体积的生理盐水。行为检测按照旷场实验、高架十字迷宫实验和机械痛实验的顺序进行，在行为学检测完成的第2日摘眼球取血，并收集ACC脑区组织。取血前，使用25 mL/L异氟烷麻醉小鼠。整个实验过程采用单盲方式，操作人员并不知悉小鼠的分组情况。

1.2.2 机械痛检测 小鼠被放在带有金属网地板的单独透明塑料笼子里，测试前先将待测实验小鼠放入实验环境中适应30 min。采用 0.08～2.00 g范围的von Frey纤维丝套组，强度从0.40 g开始，纤维丝被垂直地施加于右后爪心处，并引起轻微的弯曲。小鼠疼痛的表现包括：舔脚底、尝试撕咬纤维丝、快速躲避和缩足反应等。利用经典的up-down检测方法来确定小鼠的疼痛阈值。每只小鼠两次连续检测间隔3 min以上，共检测10次。最终以涵盖50%以上阳性反应点作为其疼痛阈值。

1.2.3 旷场实验 实验室保持较暗的光线，室温恒定25 ℃左右，湿度适宜，保持环境安静。测试前先将待测小鼠放入实验环境中30 min以适应环境，本实验在 30 cm×30 cm×30 cm 的无盖方箱中进行，将旷场划为16个格子，中间4格为中央区，其他12格为周围区。开始时将实验小鼠头部背对实验者轻缓放入旷场实验箱中央区，自由探索15 min，利用固定在正上方的视频跟踪系统(DigBehv-LR4，上海吉量，中国)进行视频记录并对小鼠运动轨迹进行分析，将小鼠在旷场内总运动距离、中央区运动距离和中央区停留时间用于统计分析。每只小鼠测试前用100 mL/L乙醇清洗方箱内壁及底部，从而消除上一只小鼠留下的信息(如气味、大小便等)，减少实验误差。

1.2.4 高架十字迷宫实验 实验环境同旷场实验。高架十字迷宫由两个开臂(25.0 cm×8.0 cm×0.5 cm)、两个闭臂(25.0 cm×8.0 cm×12.0 cm)和中央平台区域(8.0 cm×8.0 cm)组成。实验设备放置在离地面高50 cm处。测试前先将待测实验小鼠放入实验环境中30 min 以适应环境。将实验小鼠轻缓地放置于中央平台区域，小鼠头朝向开臂，实验人员远离高架十字迷宫。同样利用固定在正上方的视频跟踪系统(DigBehv-LR4，上海吉量，中国)记录小鼠5 min内的运动轨迹，分析实验小鼠在开臂和闭臂的停留时间及总进臂次数。为消除动物的嗅觉刺激，每次测试前均用100 mL/L乙醇擦洗十字迷宫。

1.2.5 酶联免疫吸附实验(enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA) 收集小鼠全血后室温放置30 min，4 ℃，1 000g离心20 min，取上清冻于-80 ℃。ELISA检测前30 min将检测试剂盒和冻存血清放置于室温。分别根据不同ELISA试剂盒的说明书检测小鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β含量。检测结果=(小鼠炎症因子浓度/对照组平均浓度)×100%。

1.2.6 实时定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-PCR) 小鼠被异氟烷深度麻醉后处死，于解剖镜下取ACC脑组织，并立即放入无酶 EP 管中，采用总RNA提取试剂盒(DP451，TIANGEM)提取RNA。先加入100 μL裂解液RLA，用超声粉碎机粉碎组织，再加入10 μL蛋白酶K，混匀后室温放置5 min。低温12 000 r/min 离心2 min后取上清，加入基因组DNA去除柱，接着低温12 000 r/min离心30 s，在滤液中加入700 mL/L乙醇，加入的量与上清体积相同，混匀后将得到的溶液和沉淀一起转入RNase-Free吸附柱CR4中，低温12 000 r/min离心30 s，弃废液。在吸附柱中加入700 μL去蛋白液RW3，低温12 000 r/min离心30 s，弃废液。最后用500 μL漂洗液RW漂洗吸附柱两次，倒掉废液，晾干后将提取的RNA溶于40 μL RNase-Free ddH2O中。利用逆转录试剂盒(KR116，TIANGEM)将RNA逆转录为cDNA，取1 μL cDNA作为模板进行PCR扩增，加入相应引物按照试剂盒(FP201，TIANGEM)说明书配制PCR反应液，实时扩增后计算 2-ΔΔCt值。检测结果以各组小鼠2-ΔΔCt值与对照组平均值的百分比表示。使用引物序列(5′-3′)如下。

GAPDH-F: CCAGCTCGTCCTGTAGACAA,

GAPDH-R: GC CTTGACTGTGCCGTTGA;

IL-6-F: GACTGGGGATGTCTG TAGCTC,

IL-6-R: CAACTGGATGGAAGTCTCTTGC;

TNF-α-F: GTGATCGGTCCCCAAAGG,

TNF-α-R: GGTGTGGG CCATAGAACTGATG;

IL-1β-F: GCAACTGTTCCTGAACT CAACT,

IL-1β-R: ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT。

2 结果

2.1 CFA足底注射诱导小鼠产生疼痛样行为

为明确足底注射CFA可诱发小鼠慢性炎性痛，我们利用von Frey纤维丝检测了不同实验组小鼠注射CFA后机械痛阈值的变化。结果表明：与对照组相比，CFA注射1、7、14、28 d的小鼠机械痛阈值均显著降低(P<0.01，图1)，但CFA注射不同时间组间无明显差异，提示CFA足底注射后1 d即可诱导小鼠出现疼痛样行为，且疼痛样行为至少能够持续4周。

bP<0.01 vs 对照组。图1 CFA注射显著降低小鼠的机械痛阈值

2.2 模型小鼠伴发有焦虑样行为

为了验证模型小鼠是否能够产生焦虑样行为，我们采用旷场和高架十字迷宫实验检测了各组小鼠的焦虑样行为。旷场实验表明：与对照组相比，CFA注射14 d和28 d组小鼠在中央探索的时间和距离显著降低(P<0.01)，而CFA注射1 d和7 d组小鼠在中央探索的时间和距离却无显著性变化(图2A～C)；各组小鼠的总运动路程无明显差异(图2D)。高架十字迷宫实验进一步验证了我们的发现，CFA注射14 d和28 d组小鼠开臂探索时间与对照组小鼠相比显著降低(P<0.01，P<0.05)，但闭臂探索时间却明显增加(P<0.01，图3A～C)，总进臂次数无明显差异(图3D)。以上实验结果表明CFA注射后的模型小鼠可在2周后出现焦虑样行为。

A：旷场轨迹示意图，红框区域为中央区域；B：小鼠在旷场中央区域探索时间统计图；C：小鼠在旷场中央区域探索路程统计图；D：小鼠在旷场中总运动路程统计图。实验数值以表示，n=5。采用单因素方差分析和Tukey检验法进行组间比较， bP<0.01 vs 对照组。图2 旷场实验表明模型小鼠出现焦虑样行为

A：高架十字迷宫轨迹示意图；B：小鼠开臂探索时间；C：小鼠闭臂探索时间；D：小鼠总进臂次数。实验数值以表示，n=5。采用单因素方差分析和Tukey检验法进行组间比较， aP<0.05，bP<0.01 vs 对照组。图3 高架十字迷宫实验证实模型小鼠出现焦虑样行为

2.3 慢性炎性痛造模后不同时间血清中炎症因子的变化

为了观察CFA造模后各组小鼠外周血中炎症因子的变化，我们利用ELISA检测了小鼠血清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β的水平，发现CFA注射后7 d小鼠血清中IL-6显著升高(P<0.01)，CFA注射1、14、28 d与对照组相比无明显变化(图4A)。而TNF-α和IL-1β在CFA注射后28 d出现显著升高(P<0.01，图4B～C)。以上结果提示：IL-6在外周响应炎症的时间更早，而TNF-α和IL-1β响应炎症的时间晚。

A：血清中促炎因子IL-6含量的变化(aP<0.05， bP<0.01 vs CFA注射7 d组)；B：血清中促炎因子TNF-α含量的变化(aP<0.05， bP<0.01 vs CFA注射28 d组)；C：血清中促炎因子IL-1β含量的变化(bP<0.01 vs CFA注射28 d组)。实验数值以表示，n=5。采用单因素方差分析和Tukey检验法进行组间比较。图4 模型小鼠血清中炎症因子变化

2.4 CFA诱发慢性炎性痛不同时间段ACC脑区炎症因子的变化

采用RT-PCR检测各组小鼠ACC脑区炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1βmRNA的水平，发现CFA注射后1 d小鼠ACC脑区中IL-6、TNF-α和IL-1βmRNA水平显著性升高(P<0.01)，并且可持续至少28 d(P<0.05,P<0.01,图5)，提示小鼠外周足底注射CFA产生的疼痛信号可从外周神经感受器传递至中枢，导致ACC脑区产生炎症反应，并可持续至少4周时间。ACC脑区炎性因子升高的时间变化趋势与小鼠的疼痛样行为产生的时间完全一致，提示ACC的炎症反应与疼痛密切相关，当中枢炎症持续2周可能就激活了与情绪相关的通路，产生了焦虑并引起慢性疼痛与焦虑共病。

A：ACC脑区IL-6 mRNA水平的变化；B：ACC脑区TNF-α mRNA水平的变化；C：ACC脑区IL-1 β mRNA水平的变化。实验数值以表示，n=5。采用单因素方差分析和Tukey检验法进行组间比较， aP<0.05， bP<0.01 vs 对照组。图5 模型小鼠ACC脑区炎症因子mRNA水平增加

3 讨论

尽管现在对慢性炎性痛已经有了较多的了解，但对于如何治疗慢性炎性痛和焦虑共病并阻断其不断循环恶化依旧是一个巨大的挑战。CFA诱导的慢性炎性痛作为一种被国内外广泛认可的慢性炎性痛模型[11]，主要表现为持续性的伤害性疼痛过敏。由于其制备简单、重复性强且具有正常慢性疼痛的特点，本研究采用该动物模型阐明慢性炎性痛引起焦虑样行为及炎症反应的时间特征。PITZER等[8]报道炎性痛并不会诱发C57BL/6小鼠出现焦虑样行为，这与我们课题组及其他学者的报道相矛盾[6,7,12-13]。通过分析，我们发现产生这种差异的原因与动物的性别和种类、CFA注射量、行为检测时间点和行为检测方法相关。本课题通过观察CFA造模后不同时间点小鼠疼痛样和焦虑样行为的变化，进一步确证了CFA可诱导慢性炎性痛与焦虑共病，但是这具有一定的时间依赖性，小鼠至少在CFA注射14 d后才会出现显著的焦虑样行为，这为选择慢性炎性痛与焦虑共病的干预时间提供了参考。

中枢神经炎症反应与慢性疼痛和焦虑关系密切[14-15]，ACC则是处理疼痛和痛相关情绪障碍的核心脑区[16-17]，而IL-6、TNF-α和IL-1β是重要的促炎因子。本研究表明：CFA注射1 d，ACC脑区IL-6、TNF-α和IL-1β mRNA水平即出现显著性升高，并可持续至少28 d。但是外周血中炎症因子在CFA注射1 d后并未出现变化，这提示炎性痛导致的中枢痛敏可引起神经炎症反应的增加，进而导致焦虑症状的出现。中枢神经胶质细胞(特别是小胶质细胞和星形胶质细胞)的激活对于神经炎症反应至关重要，那么何种细胞启动了慢性炎性痛诱发的中枢炎症反应呢？已有文献报道小胶质细胞作为一种免疫细胞，对中枢微环境起着免疫监视作用[18]，且研究发现具有神经毒性的反应性星形胶质细胞是由活化的小胶质细胞诱导产生的[19]，因此我们推测ACC脑区神经炎症是由神经元的过度兴奋导致小胶质细胞活化所产生，但这种推测需要进一步的实验验证。现有研究结果提示抑制中枢神经炎症反应将会对慢性疼痛引起的焦虑产生极大程度的缓解作用。

此外，外周炎症反应也是疼痛和焦虑发病的重要原因[10]，CFA注射7 d，外周血中IL-6显著升高，提示外周IL-6升高可能参与慢性炎性痛诱发焦虑，这与之前报道的外周IL-6是诱发情绪障碍的重要介质相一致[20-21]。外周血中TNF-α和IL-1β在CFA注射28 d后呈现出显著升高趋势，提示其在后期焦虑样行为的维持中可能发挥着作用，这与伴有焦虑症的冠心病患者体内TNF-α和IL-1β水平升高相一致[22]。根据我们的实验结果可知在慢性炎性痛早期可针对IL-6进行干预，预防焦虑症状的出现；而针对长期慢性炎性痛引起的焦虑，可针对TNF-α和IL-1β进行干预治疗。

综上所述，本实验表明CFA诱导的疼痛模型小鼠可在两周后出现焦虑样行为，这可能与中枢神经炎性反应以及外周血清中IL-6升高相关，我们的研究为慢性炎性痛与焦虑共病模型小鼠的建立，以及干预治疗时间点和策略提供了借鉴。