吗啡通过miR-219-5p/NF-κB信号通路调控肺癌细胞增殖、迁移和侵袭

宫伟 王亚娟 袁素平( 保定市第一医院麻醉科,河北 保定 07000; 保定市妇幼保健院麻醉科; 中国人民解放军5 医院麻醉科)

2018年,肺癌有210 万例新病例和180 万例死亡病例,是最常诊断的癌症(占总病例的11.6%)和癌症死亡的主要原因(占癌症总死亡人数的18.4%)〔1〕。肺癌患者5年生存率为4%～17%,取决于不同的阶段和地区差异〔2〕,肺癌的治疗仍面临着巨大挑战。阿片类药物被广泛用于缓解疼痛,包括晚期癌症患者的慢性疼痛。在阿片类药物中,吗啡是临床治疗严重疼痛最有效的药物之一。在过去的几十年里,关于吗啡等阿片类药物对肿瘤生长和转移的可能影响一直存在争议〔3〕。如吗啡能刺激肾细胞癌786-O、RLC-310 细胞的增殖,促进细胞体外迁移、侵袭能力〔4〕,却抑制人肝癌细胞的移动性、肿瘤干细胞的体外特性和体内迁移能力〔5〕。因此,确定吗啡是否会增加疼痛围术期转移的风险具有重要意义。微小RNA(miRNA)调控许多生物学过程,包括细胞周期调控、细胞生长、增殖、分化、凋亡、代谢、转移等,可作为肺癌等癌症的潜在生物标志物和治疗靶点〔6,7〕。研究表明,miR-219-5p 在结直肠癌组织和细胞系中低表达,miR-219-5p 的上调发挥抑癌作用〔8,9〕。miR-219-5p 在非小细胞肺癌(NSCLC)中低表达,高表达miR-219-5p 抑制癌细胞的增殖和侵袭〔10〕。异丙酚通过上调候选肿瘤抑制因子miR-219-5p 的表达水平抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭〔11〕。核因子(NF)-κB 信号通路参与肺癌细胞的迁移和侵袭〔12〕。目前,吗啡是否通过miR-219-5p/NF-κB 信号通路来调控肺癌细胞增殖、迁移和侵袭等过程尚不清楚。本研究利用吗啡处理体外培养的肺癌细胞A549,评估吗啡对细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并结合miR-219-5p 和NF-κB 信号通路,探索其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 肺癌细胞A549 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,吗啡购自东北制药集团沈阳第一制药有限公司,β 肌动蛋白(βactin)抗体、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、-9、NF-κB p65 购自美国Cellular Signaling Technology 公司,TRIzol、Lipofectamine 2000 购自美国Invitrogen 公司, 逆转录试剂盒(批号12594025)购自美国ThermoFisher 公司,miR-219-5p、anti-miR-219-5p 购自武汉淼灵生物科技有限公司。

1.2 细胞培养 A549 细胞在含有10%胎牛血清DMEM 培养基中,并置于37℃,5%CO2培养箱中常规培养。根据不同实验目的,在第3 代处于对数生长期的A549 细胞中加入5、10、25 μmol/L 吗啡,并将正常培养的A549 细胞设为对照(NC)组。

1.3 噻唑蓝(MTT)法检测A549 细胞增殖 A549细胞以5×104个/ml 的浓度接种于96 孔板,培养24 h后,用5、10、25 μmol/L 浓度吗啡处理48 h,进行细胞增殖检测。每孔加入MTT 溶液(5 mg/ml)100 μl,孵育4 h,加入200 μl 二甲基亚砜(DMSO),震荡孵育10 min 以溶解结晶,在490 nm 波长处利用酶标仪测定吸光度(OD)值,计算细胞存活率。细胞存活率(%)= 实验组OD 值/对照组OD 值×100%。

1.4 Transwell 小室法检测A549 细胞迁移和侵袭

基质胶以1 ∶5的比例与无血清DMEM 培养基混匀,上室添加50 μl,用于侵袭测定。未补充Matrigel胶的上室用于迁移测定。将10、25 μmol/L 浓度吗啡处理后的A549 细胞重悬于无血清DMEM 培养基,并置于上室。下室中加入含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM 培养基用作引诱剂。培养24 h 后,用无菌棉签去除未穿过膜的细胞,4%甲醛固定迁移的细胞,并用1%结晶紫染色。通过显微镜捕获迁移或侵袭的细胞图像,并计数A549 细胞迁移或侵袭。

1.5 Western 印迹 A549 细胞加入RIPA 裂解缓冲液,12 000 r/min 离心10 min,获取上清。20 μg 蛋白样品用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,转移到聚偏氟乙烯膜,分别与一抗(4℃,过夜)、二抗(室温,1.5 h)孵育,化学发光液使蛋白可视化,β-actin 为内参,进行MMP-2、MMP-9、CyclinD1、NF-κB、p65 蛋白表达量化分析。

1.6 实时荧光定量PCR(qPCR) 通过使用TRIzol试剂提取A549 细胞总RNA,逆转录试剂盒用于合成cDNA,以cDNA 为模板,进行qPCR 实验。miR-219-5p 正向5′-GGTGATTGTCCAAACGG-3′,反向5′-CAGTGCGTGTCGTGGA-3′。内参U6 正向5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,反向5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。miR-219-5p 的表达量以2-ΔΔCt法计算。

1.7 细胞转染 在6 孔板中接种A549 细胞(密度为1×105个/ml),融合至70%时,利用Lipofectamine 2000 试剂,将miR-219-5p、anti-miR-219-5p 及相应阴性对照转染入A549 细胞。转染anti-miR-219-5p、anti-miR-con 的细胞以25 μmol/L 吗啡培养48 h。参考上述方法检测转染后的A549 细胞增殖、迁移和侵袭及相关蛋白表达。

1.8 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件进行t检验、单因素方差分析及组间多重SNK-q检验。

2 结 果

2.1 不同浓度吗啡对肺癌细胞A549 增殖的影响与NC 组细胞存活率[(100.00±11.35)%]比较,5、10、25 μmol/L 吗啡细胞存活率〔(92.41 ±9.24)%、(78.46±8.05)%、(51.36±5.14)%〕显著减少(F=54.039,P=0.000)。

2.2 不同浓度吗啡对肺癌细胞A549 迁移、侵袭及miR-219-5p 表示的影响 同NC 组相比,10、25 μmol/L吗啡显著减少迁移细胞数和侵袭细胞数,显著增加MiR-219-5p 表达量(P＜0.05)。10、25 μmol/L吗啡组MMP-2、MMP-9 蛋白表达量较NC组明显降低(P＜0.05)。与10 μmol/L 吗啡组比较,25 μmol/L 吗啡组以上各指标差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1、图1。

图1 不同浓度MORP 抑制肺癌细胞A549 迁移和侵袭(结晶紫染色,×200)及MMP-2、-9 表达

表1 不同浓度吗啡抑制肺癌细胞A549 迁移和侵袭(±s,n=9)

表1 不同浓度吗啡抑制肺癌细胞A549 迁移和侵袭(±s,n=9)

与NC 组比较:1)P＜0.05;与10 μmol/L 吗啡组比较:2)P＜0.05

组别迁移细胞数(个)侵袭细胞数(个)miR-219-5pMMP-2MMP-9 NC 组468.04±46.81218.39±21.851.00±0.100.86±0.090.72±0.08 10 μmol/L 吗啡组379.34±37.951)157.34±15.751)1.53±0.151)0.85±0.081)0.70±0.071)25 μmol/L 吗啡组246.79±24.661)2)96.07±9.611)2)2.53±0.221)2)0.35±0.041)2)0.28±0.031)2)F/P 值78.960/0.000123.490/0.000131.373/0.0001 42.603/0.000136.623/0.000

2.3 高表达miR-219-5p 对肺癌细胞A549 增殖、迁移和侵袭的影响 在A549 细胞中转染miR-219-5p,发现miR-219-5p 表达量明显高于miR-con 组(P＜0.05),说明成功构建高表达miR-219-5p 的A549 细胞。与miR-con 比较,高表达miR-219-5p 明显减少A549 细胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表达量(P＜0.05),且大幅降低细胞存活率、迁移细胞数和侵袭细胞数(P＜0.05)。见表2、图2。

表2 高表达miR-219-5p 对肺癌细胞A549 增殖、迁移和侵袭的影响(±s,n=9)

表2 高表达miR-219-5p 对肺癌细胞A549 增殖、迁移和侵袭的影响(±s,n=9)

与miR-con 组比较:1)P＜0.05

组别miR-219-5pCyclinD1MMP-2MMP-9细胞存活率(%) 迁移细胞数(个) 侵袭细胞数(个).34±10.14470.01±47.04217.46±21.75 miR-con 组1.02±0.101.00±0.110.86±0.080.73±0.07100.48±10.05471.04±47.05216.83±21.69 miR-219-5p 组 2.05±0.211)0.45±0.051)0.38±0.041)0.30±0.031)58.13±5.821)269.86±26.991)106.76±10.681)F 值142.147/0.000 121.646/0.000 134.385/0.000 143.041/0.00069.317/0.00070.303/0.00010 NC 组1.00±0.121.05±0.100.88±0.090.75±0.08101 3.695/0.000

图2 Western 印迹检测高表达miR-219-5p 时CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白的表达

2.4 低表达miR-219-5p 可以部分逆转吗啡对肺癌细胞A549 增殖、迁移和侵袭的影响 与NC 组比较,吗啡明显影响A549 细胞中miR-219-5p、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表达、细胞存活率、迁移细胞数和侵袭细胞数(P＜0.05)。与吗啡+anti-miR-con比较,吗啡+anti-miR-219-5p 组显著降低A549 细胞中miR-219-5p 表达量(P＜0.05),明显提高CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平(P＜0.05),并显著增加细胞存活率、迁移细胞数和侵袭细胞数(P＜0.05)。见表3、图3。

图3 Western 印迹检测低表达miR-219-5p 时CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白的表达

表3 低表达miR-219-5p 可以部分逆转吗啡对肺癌细胞A549 增殖、迁移和侵袭的影响(±s,n=9)

表3 低表达miR-219-5p 可以部分逆转吗啡对肺癌细胞A549 增殖、迁移和侵袭的影响(±s,n=9)

与NC 组比较:1)P＜0.05;与吗啡+anti-miR-con 组比较:2)P＜0.05;表4 同

组别miR-219-5pCyclinD1MMP-2MMP-9细胞存活率(%) 迁移细胞数(个) 侵袭细胞数(个).26±10.02465.89±46.55215.76±21.55吗啡组2.21±0.221) 0.40±0.041) 0.35±0.041) 0.28±0.031)53.76±5.381)248.36±24.851)98.34±9.841)吗啡+anti-miR-con 组2.25±0.240.45±0.050.36±0.040.30±0.0552.86±5.29246.37±24.6498.28±9.86吗啡+anti-miR-219-5p 组 1.24±0.132) 0.86±0.092) 0.72±0.072) 0.64±0.062)88.89±8.892)418.43±41.852) 195.37±19.552)F 值113.923131.395147.463139.25489.75391.169135.048 P 值NC 组1.00±0.101.00±0.110.86±0.090.72±0.08100 0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

2.5 低表达miR-219-5p 逆转吗啡对NF-κB 信号通路相关蛋白表达的影响 吗啡组细胞中NF-κB、p65表达量明显低于NC 组(P＜0.05),吗啡+anti-miR-219-5p 组细胞中NF-κB、p65 蛋白水平显著高于吗啡+anti-miR-con 组(P＜0.05)。见图4、表4。

图4 Western 印迹检测NF-κB、p65 蛋白表达

表4 Western 印迹检测NF-κB、p65 蛋白表达(±s,n=9)

表4 Western 印迹检测NF-κB、p65 蛋白表达(±s,n=9)

组别NF-κB p65 NC 组0.95±0.090.65±0.06吗啡组0.42±0.041)0.25±0.031)吗啡+anti-miR-con 组0.40±0.050.24±0.04吗啡+anti-miR-219-5p 组0.82±0.082)0.55±0.062)F/P 值151.145/0.000162.155/0.000

3 讨 论

吗啡通常用于癌症晚期和肿瘤围术期,其对癌症的额外镇痛作用已被广泛描述。吗啡已被证明对肿瘤进展、细胞增殖、肿瘤侵袭、血管生成、免疫功能和转移潜能产生影响,但结果却存在矛盾,因而需要进一步的研究才能得出肿瘤患者最安全的方法和药物〔13〕。在肺癌方面,田蜜等〔14〕研究表明,A549 细胞使用10、20、40 μg/ml 吗啡处理后,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡被明显促进,均表现出剂量依赖性;另外,吗啡以剂量依赖方式促进A549 细胞的迁移。也有研究得到不同的结果,童建华等〔15〕对0.3、3.0、30.0 μg/ml 浓度吗啡影响A549 细胞增殖与凋亡进行分析,发现吗啡明显促进细胞增殖,且呈剂量依赖性;30 μg/ml 浓度吗啡处理A549 细胞后,凋亡率由(6.4±0.6)%降至(3.8±0.5)%。李彬等〔16〕报道指出,0.1、1.0、10.0 μmol/L 吗啡以剂量依赖方式提高A549 细胞的侵袭和迁移能力,10 μmol/L 吗啡显著增加MMP-2、MMP-9、Fascin 蛋白表达量。本研究结果与Tian 等〔17〕的报道一致。此外,本文10、25 μmol/L吗啡明显降低迁移细胞数、侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9 蛋白水平,与文怀昌等〔18〕研究相符。李彬〔19〕研究表明,0.1、1.0 μmol/L 浓度的吗啡增加A549 细胞侵袭数目和迁移速率,而当吗啡浓度达到10.0 μmol/L 时,细胞侵袭能力和迁移能力会减弱。由此可见,药物浓度可能是影响吗啡作用的重要因素之一。本研究提示,吗啡在肺癌中的作用与miR-219-5p 密切相关。肿瘤的发展是一个复杂的进化过程,受致癌和抗肿瘤因子的调控〔20〕。研究发现,miRNA 通过调控靶基因的表达,在肿瘤发生过程中发挥重要作用。miR-219-5p 在胃癌组织和细胞系中明显低于癌旁组织和正常胃上皮细胞;miR-219-5p 过表达显著降低胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭;miR-219-5p 沉默则表现出完全相反的效果〔21〕。卵巢癌细胞中miR-219-5p 过表达可通过靶向高迁移率蛋白A2 抑制人卵巢癌细胞SKOV3 细胞增殖、迁移和侵袭〔22〕。结直肠癌组织中miR-219-5p 表达下调;miR-219-5p 过表达可抑制细胞增殖,抑制磷脂酰肌醇3-激酶/Akt 信号通路的激活,下调CyclinD1、周期蛋白依赖性激酶4、6 的表达〔23〕。由此可见,miR-219-5p 作为抑癌因子影响胃癌、结直肠癌、卵巢癌等肿瘤进展。本实验与前述研究相符。

吗啡抑制NF-κB 信号通路相关蛋白NF-κB、p65 表达。NF-κB 信号通路在肺癌发生发展中发挥着重要作用〔24〕,miRNA-506 通过抑制NF-κB p65 表达抑制肺癌细胞活力〔25〕。本文结果提示,吗啡发挥抗肺癌的功能是通过上调肺癌细胞中miR-219-5p,抑制NF-κB 信号通路来实现的。

综上,吗啡能够抑制肺癌细胞A549 的增殖、迁移和侵袭能力,机制与调控miR-219-5p/NF-κB 信号通路有关,其机制仍需深入探究。