跑台训练联合瑞舒伐他汀干预对AMI大鼠心肌细胞活性、能量代谢及SPRED1蛋白的影响

李景辉 李婷婷 吴兴森 曾丁邻 ( 漳州正兴医院,福建 漳州 363000; 漳州市第三医院)

急性心肌梗死(AMI)是由于冠状动脉发生急性或持续性的缺血缺氧,从而引发的心肌坏死〔1〕。该疾病在欧美地区最为常见,美国每年约有150 万人患AMI,目前中国急性心肌梗死的发病率也显著上升,每年新增患者达20 万以上〔2〕。AMI 发病时患者梗死心肌呈凝固性坏死,病灶区伴充血、水肿及炎性细胞浸润症状急性期结束后,梗死心肌将被纤维组织代替,诱发心室增大、心肌代偿性肥厚,并影响心脏收缩和舒张功能,进而影响患者的预后,而心肌收缩功能与心肌能量代谢密切相关〔3,4〕。能量代谢是心脏活动的物质基础,三磷酸腺苷(ATP)是维持心脏正常生命活性的直接能量来源,改善梗死心肌的能量代谢可有助于减轻急性心肌缺血再灌注损伤〔5〕。SPRED1 蛋白是Sprouty 家族的相关蛋白,目前有研究证实,SPRED1 蛋白在很多组织中均有表达,可参与骨形态进展,在造血的过程中同时SPRED1 会诱导气道嗜酸细胞大量增多〔6〕。多项研究发现,SPRED1 在胚胎的多个器官组织,如大脑,心脏和肺等均呈现低表达,同时显示出SPRED1 在胚胎发育期间占有重要地位〔7〕。运动训练是心肌梗死后康复训练的重要方式之一,现有研究表明,适宜的运动训练不仅可以提高心肌梗死后心脏的舒缩功能,而且可以减轻梗死后的心室重构〔8〕。瑞舒伐他汀是一种新研究的他汀类药物,对抗炎症、抗氧化和调节免疫力有显著的作用,也因此受到临床上的广泛关注〔9〕。目前有研究证实,瑞舒伐他汀对心肌梗死后心功能的作用,心肌细胞的凋亡情况和心室重塑均有明显的改善,但对与瑞舒伐他汀对改善的作用机制尚不清楚〔10〕。本研究探讨跑台训练联合瑞舒伐他汀对AMI 大鼠心肌细胞活性和能量代谢的作用机制及其对AMI 大鼠中SPRED1 蛋白的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雄性大鼠购自吉林大学基础医学院动物实验中心,共计50 只。体重250～300 g,常温下适应性饲养大鼠7 d。

1.2 试剂和仪器 HX-100E 小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司);生物信号采集分析系统(成都邀生电子有限公司);PCR 扩增仪(美国Applied Biosystems);DYY-6C 电泳仪(北京市六一仪器厂);BX41 显微镜(日本Olympus 公司);瑞舒伐他汀钙片(阿斯利康制药有限公司);水合氯醛(天津市科密欧化学实际有限公司);ATP 酶试剂盒(南京建成公司);SPRED1 兔多克隆抗体(Santa Cruz 公司);DAB 显色试剂盒(上海易利生物科技有限公司)。

1.3 动物分组与模型建立 把50 只大鼠分为5 组,每组10 只。假手术(sham)组;AMI 大鼠模型(AMI)组,AMI 大鼠给予跑台训练进行干预组(train组);AMI 大鼠给予瑞舒伐他汀干预组(Ros 组);AMI 大鼠模型给予跑台训练联合瑞舒伐他汀干预组(train+Ros 组)。把所有实验大鼠进行麻醉处理,给大鼠气管插管后,链接呼吸机和心电图机,对手术的部位进行消毒,在第3～4 肋之间,从左到右把皮肤剪开,分离大鼠的肌肉后取出心脏,结扎大鼠的左冠状动脉前降支部位。当大鼠左室前壁的心肌部分发白,收缩功能明显变弱,心电图机上显示ST 段有显著升高时,说明成功造模。sham 组除了对左冠状动脉前降支不结扎外,其他的手术步骤和其余两组相同。手术后各组连续注射3 d 的青霉素溶液,以防止术后有感染的情况发生。

造模成功后,sham 组、AMI 组及train 组给予等体积量蒸馏水灌胃,1 d/次;Ros 组及train+Ros 组每只大鼠给予0.5 mg 瑞舒伐他汀灌胃;train 组及train+Ros 组每天早晚各进行1 次30 min 的跑台运动,每周运动5 d,跑步机的转速为16 m/min;所有大鼠连续干预4 w。

1.4 标本采集 分别测定每组大鼠的心功能。4 w后,开胸后再次钳夹左前降肢,于颈静脉注射2%伊文思蓝2～3 ml,确定未缺血区和缺血区,并经耳缘静脉推注10%氯化钾(KCl),使心脏停于舒张期,剪下心脏,摘取所有大鼠的心脏后,沿着左心室的长轴把心脏的梗死区分为两份,取出梗死区的组织,sham组取相同位置的组织,部分用于苏木素-伊红(HE)染色实验,另一部分用液氮进行保存,用于蛋白的检测。

1.5 大鼠心功能指标测定 给药结束后麻醉所有大鼠,检测大鼠的左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)的心功能指标,以上4 项指标均测量3 次,取平均值。

1.6 TCC 法检测心肌梗死面积 用生理盐水洗净心脏后,用保鲜膜包裹好置于-20℃冷冻30～60 min。取出心脏,使用刀片小心将心脏横切5 片置于培养皿中,用1%TTC 溶液30℃避光染色10～15 min,取出心脏,小心将心脏翻面,继续37℃避光染色10～15 min。用相机拍照后并计算梗死区域的面积。

1.7 心肌组织病理学形态观察 制备心肌组织切片,每个样本取不连续3 张切片,常规脱蜡至水,苏木精液染色、75%盐酸乙醇分化、氨水处理、酸化伊红乙醇染色处理后水洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固,光镜下观察。

1.8 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡 取出大鼠的心肌组织,分别切成0.5 cm 的块状,固定后石蜡包埋、把组织进行切片。用TUNEL 法把石蜡切片进行染色,所有的步骤按照试剂盒上的说明严格进行。每张石蜡切片选取5 个不交叉的视野进行观察,凋亡的心肌细胞为深棕色。细胞凋亡率=细胞凋亡的数量/细胞的总数×100%。

1.9 心肌ATP 酶活力检测 每组取部分心脏,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗血迹,用组织匀浆机制备匀浆,离心机3 500 r/min,离心10 min 后取上清液,蛋白浓度采用考马斯亮蓝法定量,定磷法于660 nm 下检测A 值,并计算ATP 酶活力(以每小时每克心肌组织蛋白产生mmol Pi 单位酶表示),实验步骤参考试剂盒说明书严格进行。

1.10 Western 印迹检测SPRED1 蛋白表达 将各组的心肌组织分别提取100 mg,组织裂解并提取核蛋白,分装后,-20℃保存。将蛋白溶液与缓冲溶液按照4 ∶1比例进行混均,然后将其煮沸,使其变性。在电泳板内分别注入50 μm 的蛋白样品,把电泳后的样品转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入脱脂奶粉,并进行封闭,时常为1 h。加入1 抗后进行TTBS 漂洗,每次漂洗10 min,一共进行3 次漂洗,最后加入2 抗对溶液进行稀释,再在常温的环境中封闭1 h。取出PVDF 膜,TTBS 漂洗10 min×3,二氨基联苯胺(DAB)显色后数码相机照相。

1.11 统计学分析 采用SPSS19.0 软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1 各组心功能指标比较 与sham 组比较,AMI组LVEDD 和LVESD 均显著升高,LVEF 和LVFS 显著降低(P＜0.05);干预后train 组、Ros 组和train+Ros 组LVEDD 和LVESD 均低于AMI 组,而LVEF和LVFS 明显高于AMI 组,并且3 组效果呈递增排列,train+Ros 组心功能水平优于train 组、Ros 组(P＜0.05),见表1。

2.2 各组心肌梗死面积比较 sham 组心肌组织无梗死情况。AMI 组、Train 组、Ros 组和Train 组+Ros组均出现了梗死的组织,并且心肌梗死面积呈递减排列,AMI 组心肌梗死面积最大,train+Ros 组心肌梗死面积明显低于train 组和Ros 组(P＜0.05),见表1。

表1 各组心功能、心肌梗死面积比较(±s,n=10)

表1 各组心功能、心肌梗死面积比较(±s,n=10)

与sham 组比较:1)P＜0.05;与AMI 组比较:2)P＜0.05;与train 组比较:3)P＜0.05;与Ros 组比较:4)P＜0.05;下表同

组别LVEDD(mm)LVESD(mm)LVEF(%)LVFS(%)心肌梗死面积(%).00±0.00 AMI 组6.26±0.511)10.41±0.481)52.05±2.831)27.73±1.051)52.68±7.811)train 组5.31±0.481)2)8.72±0.431)2)58.17±2.561)2)31.54±1.111)2)38.31±5.121)2)Ros 组4.89±0.451)2)3)7.95±0.511)2)3)61.37±2.031)2)3)33.49±0.981)2)3)29.67±5.181)2)3)train+Ros 组4.21±0.321)2)3)4)6.77±0.641)2)3)4)69.62±1.961)2)3)4)38.21±0.721)2)3)4)23.51±6.711)2)3)4)F/P 值51.41/＜0.001133.20/＜0.001224.90/＜0.0014 sham 组3.92±0.215.57±0.6378.16±0.7643.62±0.430 74.20/＜0.001119.40/＜0.0001

2.3 各组心肌组织病理学形态比较 sham 组心肌细胞均整齐排列,心肌细胞的边界也很清晰,细胞核及横纹清楚可见。与sham 组比较,AMI 组、train组、Ros 组和train+Ros 组心肌细胞出现明显的损伤,并且在细胞的梗死区均出现了炎性细胞的浸润,细胞的损伤程度从重到轻分别为AMI 组、train 组、Ros 组、train+Ros 组,并且train+Ros 组心肌细胞排列也趋于整齐,炎症细胞浸润明显减少,在梗死区周边可见血管组织,明显优于AMI 组、train 组、Ros 组,见图1。

图1 各组心肌组织(HE 染色,×400)

2.4 各组心肌细胞凋亡TUNEL 检测结果比较 和sham 组〔(5.12±0.46)%〕相比,AMI 组心肌细胞凋亡率显著增加〔(39.87±1.63)%,P＜0.05〕;和AMI组相比,train 组〔(34.18±1.21)%〕、Ros 组心肌细胞凋亡率〔(39.27 ± 1.35)%〕 和train + Ros 组〔(18.36±0.87)%〕均明显降低(P＜0.05),且train+Ros 组心肌细胞凋亡率明显低于train 组、Ros 组(P＜0.05),见图2。

图2 各组心肌细胞凋亡(TUNEL 染色,×400)

2.5 各组心肌ATP 酶活力比较 和sham 组比较,AMI 组ATP 酶活力显著降低(P＜0.05);干预后的train 组、Ros 组和train+Ros 组ATP 酶活力显著高于AMI 组(P＜0.05),且train+Ros 组ATP 酶活力高于train 组和Ros 组(P＜0.05),见表2。

表2 各组心肌ATP 酶活力比较(±s,n=10)

表2 各组心肌ATP 酶活力比较(±s,n=10)

组别Na+-K+-ATP 酶(mmol Pi/g Pro)Ca2+-Mg2+-ATP 酶(mmol Pi/g Pro)5.68±0.796.73±1.05 AMI 组4.22±0.801)5.40±0.761)train 组4.79±0.921)2)5.98±1.131)2)Ros 组4.85±0.441)2)3)6.19±0.901)2)3)train+Ros 组5.21±0.291)2)3)4)6.56±0.651)2)3)4)F/P 值sham 组6.119/0.000 53.267/0.019 6

2.6 各组SPRED1 蛋白表达比较 AMI 组SPERD1 蛋白表达(2.23±0.15)显著高于sham 组(1.00±0.02,P＜0.05);与AMI 组比较,train 组、Ros 组和train+Ros 组SPERD1 蛋白表达均显著降低(1.45 ± 0.11、1.03 ± 0.09、0.68 ± 0.06,P＜0.05),且蛋白表达呈逐渐递减趋势,train+Ros 组心肌组织中SPERD1 蛋白低于train 组和Ros 组(P＜0.05),见图3。

图3 各组SPRED1 蛋白表达

3 讨 论

研究表明,药物预处理和运动对受损的心肌组织均具有保护作用,可有效地降低心律失常发生率、改善心脏的收缩功能、增强心脏对损伤的耐受能力等〔11〕。前期有研究显示,瑞舒伐他汀在急性冠状动脉综合征中发挥抗氧化作用,有效降低氧化应激水平及心肌损伤标志物的水平〔12〕。研究指出,运动能够增加机体氧容量,阻止一些代谢疾病的发生;运动训练还能通过调节一氧化氮通路,影响血管舒张,从而阻碍心脏疾病中内皮细胞的死亡,适当强度的运动训练还可减少心血管疾病的发生〔13〕。

瑞舒伐他汀对细胞内胆固醇合成过程中限速酶的活性具有一定的抑制作用,即可抑制胆固醇的合成,胆固醇合成量降低将导致细胞表面低密度脂蛋白(LDL)受体上调,血浆LDL 代谢加快〔14〕。瑞舒伐他汀还可抑制极低密度蛋白的生成,在高胆固醇血症治疗工作中具有极高疗效。临床研究发现,对急性冠脉综合征患者进行大剂量瑞舒伐他汀治疗后,患者心肌梗死、心绞痛、死亡等发生率下降20%左右,脑卒中发生率也显著下降。本研究结果提示,跑台训练和瑞舒伐他汀的联合使用可明显改善AMI大鼠的心功能,对心肌细胞的凋亡也能进行有效的抑制,但跑台训练和瑞舒伐他汀联合干预的效果最好。李丹等〔15〕研究发现,心肌梗死急性期即进行中等强度的跑台训练可提高大鼠的存活率,还能有效减小缺血心肌的梗死面积,改善左心室重构。吴春涛等〔16〕对AMI 大鼠研究发现,瑞舒伐他汀可改善AMI 大鼠心脏功能,可能通过调节基质金属蛋白酶(MMP)2/9/10、Perionstin 蛋白及TGF-β1 的mRNA表达来调控其心肌重构。

能量代谢是心脏活动的物质基础,ATP 是维持心脏正常生命活动的直接能量来源,有研究表明,心肌ATP 的水平与其收缩能量呈正相关,而能量代谢的恢复能够减轻细胞损伤也被证实〔17,18〕。本研究结果显示,AMI 组大鼠心肌细胞发生损伤,进而导致ATP 生成不足,导致心肌细胞能量代谢障碍,跑台训练和瑞舒伐他汀均可促进ATP 大量生成,但跑台训练和瑞舒伐他汀联合使用的效果最佳,可见跑台训练联合瑞舒伐他汀干预可显著增加ATP 的生成,恢复受损心肌细胞的能量代谢功能。刘媛媛等〔19〕通过对动物进行8 w 的跑台训练后发现,适度的运动对心肌能量的代谢可进行一定程度的优化,并且使心肌代谢转化糖酵解和葡萄糖,但对脂肪酸的利用无显著的变化。本研究结果提示,跑台训练联合瑞舒伐他汀可对心肌组织血管新生负性调控因子SPRED1 进行有效的调节,进而调节血管的新生。郑瑞玲等〔20〕研究发现,活血益气方可促进AMI 大鼠梗死边缘区血管的新生,治疗效果较为显著,其作用机制通过下调SPRED1 的表达发挥作用,这与本文研究结果相似。

综上,跑台训练联合瑞舒伐他汀可有效减少急性心肌梗死细胞的凋亡,改善心肌能量代谢,同时对SPRED1 的表达有一定的抑制作用。