臭氧水冷杀菌工艺对年糕中椰毒假单胞菌和扩展青霉菌的抑制作用研究

陈山乔

（宁波市农业科学研究院，浙江宁波 315040）

臭氧是一种不稳定的氧化剂，在短时间内会降解为氧气，其溶于水形成的臭氧水具有潜在的杀菌作用[1]。臭氧杀菌过程属于生物化学氧化反应[1-2]，主要机理是其氧化性导致微生物的膜结构等的完整性降低，造成细胞的通透性改变，或干扰其物质能量代谢，从而抑制其增殖[2]。扩展青霉菌（Penicilliumexpansum，PE）在自然界中广泛分布，是多种食品腐烂发霉的重要原因之一，且具有潜在的致癌毒性风险，因此在研究中需要特别关注[3]。椰毒假单胞菌（Pseudomonas cocovenenans，PC）为革兰氏阴性短杆菌，有食用含有由椰毒假单胞菌属酵米面亚种产生的“米酵菌酸”的“酸汤子”而发生惨剧的案例[4]。因此其在研究中也需要特别的关注。

以年糕为代表的米制品由于其天然缺乏抑菌活性物质，微生物易于摄取利用，因此在生产后的贮藏和流通过程中，极易由于微生物的增殖而腐败，造成严重的食品安全问题。因此，目前行业内普遍在年糕包装后进行水热杀菌，但其会使年糕质构和口感发生变化，使得产品发硬，弹性降低。针对这一问题，本研究引入臭氧冷杀菌工艺，以PC、PE为研究对象，验证了臭氧对PC与PE的杀灭作用，并使用年糕样本作为材料进行了灭菌效果验证，得出了浓度、温度对臭氧在年糕中杀菌效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

可控恒温式反应器（水套式自动温控，带有T形搅拌，容积30 L），赛默飞世尔科技（中国）有限公司；臭氧发生器（氧气源电晕式），深圳市飞立电器科技有限公司；臭氧浓度测定仪，邦亿精密量仪（上海）有限公司；PE菌株、PC菌株，中国普通微生物菌种保藏管理中心；培养基、培养皿，上海生工生物有限公司；麦氏比浊管，广东环凯生物科技有限公司；无菌水、臭氧，实验室现场制备。

1.2 试验方法

1.2.1 臭氧水体外杀菌试验

分别使用营养肉汤培养基和改良马丁培养基摇瓶液体培养PC和PE至平台期。在恒温反应器中加20 L灭菌水并开启搅拌。待其达到设定的温度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃及35 ℃）后，通入臭氧并用臭氧检测仪实时测定水中臭氧浓度，达到设置浓度（0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.00 mg·L-1、4.00 mg·L-1、8.00 mg·L-1、10.00 mg·L-1、20.00 mg·L-1）后，加入通过麦式比浊法测定并稀释的前述培养菌液，使最终水中的菌体浓度为1×105CUF·mL-1，开始计时的同时关闭臭氧发生器。处理前5 min以10 s为间隔对反应器中的水进行5 mL每次的周期性采样，5～15 min以30 s为 间 隔，15～30 min以1 min为 间 隔，30～60 min以2 min为间隔。采集结束后记录反应器中残余的臭氧浓度。采集水样，分别对被试菌进行菌落计数，以菌落总数为未检出（ND）所对应的时间为最小杀灭接触时间，计算其杀菌半衰期，用以衡量杀菌速度。

1.2.2 菌落总数检测

采用平板记数法，PC使用平板菌落计数培养基，PE使用孟加拉红培养基。

1.2.3 臭氧水在年糕杀菌中的验证

年糕成型后，通过表面涂抹前述由麦式比浊法定量稀释后的菌液，接种被试微生物，之后置于3种浓度臭氧水中冷却浸泡10 min（12.5 mg·L-1、10.0 mg·L-1、7.5 mg·L-1），晾干后进行真空包装。之后在室温下贮藏，每3 d进行一次采样，检测其菌落总数。

2 结果与分析

2.1 臭氧水的灭菌效果

2.1.1 臭氧水对被试微生物的杀灭作用

为了考察臭氧水对PC和扩展青霉菌的杀灭作用，本文以臭氧浓度为变量，在25 ℃下，由低到高设置了8个试验组，以完全杀灭被试微生物的最小接触时间作为表现杀菌能力的特征指标进行了试验，试验结果如表1所示。

由表1可知，臭氧浓度越高，其最小杀灭接触时间越短，半衰期也越短。对于PC，在20.0 mg·L-1的臭氧质量浓度下，达到未检出的接触时间仅为2.67 min，在臭氧质量浓度为0.50 mg·L-1时，为了获得同样的消毒效果，接触时间则应该不少于44 min。对于PE，同样浓度的臭氧水，其杀灭速度较PC更慢，在20.0 mg·L-1的臭氧质量浓度下，达到未检出的接触时间为3.17 min，在臭氧浓度为0.50 mg·L-1时，必需的接触时间则高达54.00 min。对于这两种不同的被试微生物，其臭氧水杀菌效率的不同，可能是由于其细胞结构存在差异。例如，真菌细胞有着更完善的抗氧化系统[5]，以及抗逆性更强的细胞壁[6]。

2.1.2 不同温度臭氧水对微生物杀灭作用的影响

在不同温度下，10.0 mg·L-1的臭氧水，其最小杀灭接触时间和灭菌终止时水中的臭氧残留如表2所示。随着温度的上升，两种被试菌株的最小杀灭接触时间有略微上升，即其杀菌性能有所下降。结合终止时臭氧残留量可知，出现这一现象的原因可能在于随着温度的升高，臭氧在水中的降解、析出速度加快。考虑到杀灭接触时间的变化幅度较小，因此在实际工艺中无需对温度进行额外的控制。

表2 不同温度下臭氧的质量浓度

2.2 臭氧水在年糕杀菌中的验证

如表3所示，7.5 mg·L-1的臭氧水处理未能完全将年糕杀菌至无检出，而10.0 mg·L-1的臭氧水处理能够维持无检出3 d，12.5 mg·L-1的臭氧水处理则可以维持6 d。根据《年糕》（SB/T 10507—2008）[7]和《食品安全国家标准 速冻面米与调制食品》（GB 19295—2021）[8]的要求，7.5 mg·L-1、10.0 mg·L-1、12.5 mg·L-1的臭氧水处理分别维持年糕中被试微生物菌落总数合格的天数为0 d、6 d、12 d（以上）。从实际接种后年糕的杀菌结果来看，臭氧的实际灭菌效果低于纯粹的水环境，这可能是一部分菌体埋入了年糕中，减少了实际与其作用的臭氧含量所致。

表3 贮藏年糕的菌落总数

3 结论

臭氧能够有效杀灭年糕中的主要致腐菌。体外灭菌试验表明PC和PE与臭氧水的最小杀灭接触时间随臭氧浓度的增加而减小，杀菌半衰期也随浓度的增加而减小。杀菌过程中的温度升高会轻微的减小臭氧水的灭菌效果，但是其变化幅度较小，实际生产工艺开发中无需进行控制。对接种被试菌的年糕进行杀菌的试验表明，10.0 mg·L-1以上的臭氧浓度才能够彻底杀灭年糕中的致腐菌，且12.5 mg·L-1的浓度才可以将其菌落总数维持在合格水平12 d以上。