肝细胞癌免疫治疗耐药机制研究现状

代欣 曹博然 李丹 袁雅琴 李斌

肝癌是全球第六大原发性癌症，也是世界癌症相关死亡的第四大原因。乙型肝炎病毒(HBV)的高感染率以及黄曲霉素的高暴露更加大了我国肝癌的发生率。肝细胞癌(HCC)约占肝癌的90%，主要由HBV或丙型肝炎病毒(HCV)感染、酗酒或代谢综合征引起的慢性肝病背景下发展而来[1]。其5年生存率约为18%。同时由于其发病隐匿，80%以上的患者确诊时已为中晚期，致使HCC成为重大的医疗负担。

既往肝癌的治疗是以手术治疗为主的综合治疗模式，其中包括射频消融、介入治疗、靶向治疗、化疗、放疗等，同时也包括针对于乙型肝炎等基础疾病的治疗，如抗病毒治疗、保肝利胆及对症支持治疗等。50%～60% 的 HCC 患者最终将接受系统性治疗，传统的一线治疗主要是索拉非尼、乐伐替尼及我国自主研发的多纳非尼，二线治疗主要是是瑞戈非尼、卡博替尼、雷莫芦单抗及我国自主研发的阿帕替尼。自2017年以来，免疫检查点抑制剂包括靶向PD-1/PD-L1和CTLA-4的单克隆抗体逐渐被FDA批准应用于晚期HCC的二线治疗，随后免疫检查点抑制剂联合抗血管生成治疗被证实相较于传统一线治疗可改善患者生存，并被批准应用为晚期HCC患者的一线治疗药物。尽管免疫治疗在肝癌治疗中取得了重大进展，但仅有20%～30%的患者对免疫治疗有效。这表明HCC肿瘤微环境(TME)通过复杂的机制导致了免疫检查点抑制剂的耐药。阐明其耐药机制对于重塑免疫微环境以及提高疗效具有重要意义。

一、 肝脏免疫耐受微环境

肝脏作为一类“免疫豁免”器官，其免疫微环境具有其独特的特点。由于其不断暴露于来自环境和饮食的抗原以及来自肠道微生物群的微生物产物，肝脏必须维持高度耐受的免疫环境，具有严格的免疫调节过程。其中，非实质肝细胞(如库普弗细胞、肝星状细胞和肝窦内皮细胞、树突状细胞)在维持免疫耐受方面发挥了重要作用。与来自其他器官的树突状细胞相比，基础条件下的肝脏树突状细胞已被证明具有降低 T 细胞活化的能力[2]。这些特点虽然在机体维稳中起到重要作用，但同时也能够促进肿瘤的发生、发展。在肿瘤中，非实质肝细胞能够与肿瘤细胞、肿瘤相关成纤维细胞协同促使免疫逃逸。HCC免疫微环境伴随着上调的循环和肿瘤内淋巴细胞 PD-1/PD-L1的表达[3]，为HCC免疫治疗提供了背景，克服免疫治疗耐药成为了提升疗效的重要突破点。

二、免疫治疗耐药机制

(一) 原发性耐药

1.缺乏新抗原生成和抗原呈递缺陷：肿瘤新抗原是指肿瘤细胞基于基因组突

变而产生的异常多肽。作为肿瘤特异性抗原，新抗原相比较肿瘤相关抗原更具有免疫原性，并且不会诱导自身免疫[4]。具有较高肿瘤突变负荷(TMB)的肿瘤所产生的非同义突变较多，对应的新抗原多，并且最有可能激活免疫系统促进肿瘤识别。与其他肿瘤相比，HCC通常表现为低到中等的TMB，平均每兆数据库有5个体细胞突变，对应于大约60个非同义突变[5]。这可能是HCC对免疫治疗原发耐药的原因之一。在抗原提呈方面，TME中很大比例的树突状细胞(DC)可以表现出不成熟的表型，并伴有肿瘤抗原提呈和T细胞活化功能障碍[6]。主要组织相容性复合体(MHC)是抗原呈递所必需的，在人类MHC通常被称为人白细胞抗原(HLA)，抗原呈递细胞通过HLA-I分子将抗原肽呈递给细胞毒性 T 细胞来促进特异性免疫反应。HLA-I类分子的缺乏经常发生在HCC中，并且与免疫抑制和免疫治疗耐药相关，而HCC中HLA-I类分子的高表达与改善的HCC预后密切相关[7]。

2.抑制性免疫微环境：HCC的TME是肝脏非实质常驻细胞、肿瘤细胞、免疫细胞和肿瘤相关成纤维细胞(CAF)组成的复杂且具有空间结构的整体。具有免疫活性 HCC 的特点是富含活化的辅助 CD4+T 和细胞毒性 CD8+T细胞浸润，并且容易对ICI产生反应[1]。绝大多数HCC免疫微环境呈耗竭状态，仅有一小部分具有免疫活性，大多数HCC患者免疫浸润有限并存在大量免疫抑制性细胞,从而导致免疫抗性[8]。HCC中丰富的免疫抑制性细胞在TME中协同作用，并且与不良预后相关。HCC中较高的调节性T细胞(Treg)水平与不良预后相关，并且Foxp3+ Treg/CD4+T 细胞比率是总生存(OS)独立的预后因素[9]。Treg 细胞介导了 HCC 中 T 细胞功能障碍[10]。肿瘤内 Treg 参与了抗 PD-1 抗性肿瘤和 PD-1hiCD8+T 细胞的发展[11]，表明在HCC中靶向Treg或是逆转ICI耐药的策略之一。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是 HCC 基质细胞的主要组成之一，具有极强的可塑性，可以极化为M1表型(促炎和免疫刺激表型)和M2表型(免疫抑制表型)[12]。其中M2型巨噬细胞通过上皮间质转化(EMT)促进HCC侵袭性，并导致预后不良[13]。小鼠HCC模型中，高比例M2型TAM对ICI治疗具有更强抗药性[14]。锌指蛋白64(ZFP64)在抗PD1耐药HCC患者中上调，并促进巨噬细胞募集极化为M2抑制性表型，从而驱动HCC抗PD1抗性，而PKCα/ZFP64/CSF1通路抑制剂能够克服HCC抗PD1耐药性[15]。另外，TAM的清除也可能成为 PD-1 治疗耐药后的手段之一[16]。髓源性抑制细胞 (MDSC) 是一组异质的未成熟骨髓细胞，在肿瘤微环境中行使重要的免疫抑制功能。MDSC可以促进TAM极化为M2表型[8]，促进Treg形成及成纤维细胞分化为CAF[17]。已知循环MDSC与不良生存相关，并且较高的MDSC浸润与HCC患者不良临床预后相关[18]。在黑色素瘤中也发现，循环中低MDSC频率可提示免疫治疗后患者能够获得较好的生存[19]。多种研究证实，靶向免疫微环境中抑制性细胞也是改善ICI耐药重要研究方向之一。

3.信号通路及细胞因子：多种信号通路参与了HCC发生、发展，同时也有信号通路被明确证实参与了HCC免疫治疗原发性耐药。HCC小鼠模型研究证实，Wnt/β-catenin信号的激活促进了免疫逃逸及PD-1治疗抗性。肿瘤细胞通过激活β-catenin信号，抑制趋化因子CCL5的表达，从而降低了CD103+树突状细胞、抗原特异性CD8+ T细胞的富集[20]。Wnt/β-catenin的激活可以预测HCC患者对于ICI的疗效，并且基于免疫组化对β-catenin评估可以识别ICI反应良好的亚组[21]。使用临床前模型证实，生物纳米颗粒递送siRNA下调β-catenin 能够增强抗PD-1治疗反应[22]。JAK1/2功能缺失既往已被证实参与了ICI获得性耐药，近年也发现，肿瘤细胞JAK1/2突变抑制了PD-L1表达上调，导致PD-1治疗原发性耐药[23]。可溶性细胞因子在介导免疫治疗耐药中也起到重要作用。TGF-β在HCC中含量丰富，能够促进肿瘤细胞增殖和侵袭。TGF-β1与PD-L1共表达预示着HCC较差的预后[24]。研究发现，尿路上皮癌中TGF-β能够通过限制T细胞浸润抑制抗肿瘤免疫，TGF-β阻断联合抗PD-L1抗体治疗能够加速肿瘤消退[25]。目前关于PD-1单抗联合TGF-β抑制剂的临床试验(NCT02423343)也正在进行当中。

(二)获得性耐药 获得性耐药指ICI治疗最初阶段取得疗效，但随后疾病出现临床和/或放射学的进展或复发。与原发性耐药不同，在规避或逆转ICI获得性耐药方面还没有取得突破性进展，其机制的研究也因为缺少统一诊断标准、难以获得良好的临床样本、大量DNA/RNA测序发现的差异基因较少等原因困难重重。目前关于ICI获得性耐药机制研究集中在黑色素瘤及非小细胞肺癌中较多。对于HCC，目前考虑可能与以下几方面有关。

1.新抗原产生缺失：癌症发展过程中，高TMB导致的新抗原表达量升高，有利于免疫系统识别肿瘤细胞从而增加ICI的疗效，这一点在原发性耐药中已详述。但在获得性耐药中，使用ICI后肿瘤细胞和免疫系统的相互作用导致肿瘤内部发生克隆选择，更多免疫原性或新抗原表达水平低的肿瘤细胞被保留，进而引发ICI的获得性耐药。此外，与其他原发肿瘤不同，肝脏多灶病变十分常见，尽管这些肿瘤在遗传上起源于相似的细胞，但它们彼此之间存在显著差异。随着肿瘤内异质性的增加，免疫原性低的克隆更有可能被选择，从而导致其对ICI敏感性降低[26]。总之，通过各方面因素导致肿瘤新抗原产生的缺失，是ICI获得性耐药的重要驱动机制。

2.免疫细胞耗竭及免疫检查点上调：免疫细胞耗竭是指在癌症发展及免疫治疗过程中免疫细胞表现出功能障碍状态。在疾病发展过程中发现多种免疫细胞出现上述耗竭表型。自然杀伤细胞(NK)作为固有免疫的第一道防线，通过分泌颗粒酶、穿孔素、TNF-α等杀伤肿瘤细胞。HLA-I类分子下调的肝癌细胞可避免其被细胞毒性T细胞特异性杀伤，而这类细胞的杀伤依赖于NK细胞的非特异性杀伤。在HCC TME中发现了耗竭表型的NK细胞，并伴随IFN-γ和TNF-α产生减少[27]。CD8+T细胞是免疫系统杀伤肿瘤最主要的效应细胞之一。然而随着疾病的发展，肿瘤抗原特异性CD8+T细胞逐渐出现耗竭表型，主要特点是杀伤效应受损以及伴随其他抑制性免疫检查点(TIM3、VISTA、TIGIT、LAG3等)的出现。HCC患者样本中发现，表达多个免疫检查点的严重耗竭 CD8+T 细胞的高度富集与较差的无进展生存期和总生存期相关，并且这种T细胞亚群可以作为HCC相关的新型生物标志物[28]。在长期的ICI治疗过程中，HCC中多种免疫细胞的耗竭可能是ICI获得性耐药的潜在机制，并且多种针对于免疫检查点抑制的联合应用有望改善HCC患者预后。

三、展望

近年来，免疫治疗在多种癌症中发展迅速，极大地改善了患者的生存，甚至让部分患者实现了长期的“带瘤生存”。但这部分患者仅是庞大的癌症患者群体中的小部分。如何筛选免疫治疗的响应人群以及如何克服免疫治疗耐药是当前亟需攻克的科学问题。随着组学技术、基因编辑技术、类器官培养技术的发展，未来对于ICI耐药机制的探索会更加深入透彻。HCC中，免疫联合抗血管生成治疗已经显著提升了免疫单药治疗患者的总生存，其他联合治疗模式包括“免疫联合免疫”、“免疫联合靶向”、“免疫联合放疗”等也均在探索研究中。相信未来联合治疗策略将会改善ICI耐药，为患者带来更好的生存获益。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。