对常用消毒剂降解RNA/DNA病毒核酸效果的评估

张 浩，邬锐军，刘利军，郝瑞军，魏玉环，王建华，马骏骥

（内蒙古正大食品有限公司，内蒙古 呼和浩特 010020）

随着我国经济的高速发展，规模化猪场快速兴起，由此引发的猪病问题日益突出，严重制约了猪场的发展[1]。疫病不但能够降低猪的生产性能，还能够致使猪群大规模死亡，造成经济损失[2]。良好的生物安全措施是控制疫病的关键，消毒是规模化猪场生物安全的重要措施之一[3]。猪场常见的病毒主要分为RNA病毒和DNA病毒，目前，常用的消毒剂对这2种病毒的消杀降解作用是否全面有效，很少有系统的研究。

核酸检测在实验室中最常见的问题就是核酸污染，这对核酸检测的准确性有重大影响。使用何种消毒剂以及如何制定合理的消毒程序，成为PCR实验室最需要重视的问题。RNA和DNA是大多数病毒的遗传物质，检测RNA和DNA含量是评价病毒滴度最节约时间和成本的有效方法之一。消毒后常用荧光定量PCR方法对农场及核酸检测实验室消毒效果进行评估。

本研究采用荧光定量PCR方法检测84消毒剂（10%）、二氯异氰尿酸钠（1∶200）、杜邦卫可（1∶200）、NaOH（2%）、NaOH（1%）、NaOH（0.5%）、微酸电解水、威特利剑（1∶400）、洁净（1∶200）、戊二醛及 75%酒精这11种常规消毒剂对RNA病毒 （勃林格蓝耳疫苗）和DNA病毒（海博莱伪狂犬疫苗）的核酸降解效果，以期为规模化养猪场的病毒防控实践及PCR实验室消毒流程规范和污染防控提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 消毒剂。84消毒剂 （有效成分次氯酸钠）（10%）、二氯异氰尿酸钠（1∶200）、杜邦卫可（过硫酸氢钾复合物）（1∶200）、NaOH （2%）、NaOH （1%）、NaOH（0.5%）、微酸电解水、威特利剑（过硫酸氢钾复合盐）（1∶400）、洁净（有效成分过氧乙酸）（1∶200）、戊二醛、75%酒精均注册有兽药产品批准文号，试验时均在有效期内。

1.1.2 试验疫苗选用。DNA病毒：海博莱伪狂犬疫苗（1头份），RNA 病毒：勃林格蓝耳疫苗（1头份）。

1.1.3 主要试剂。DNA/RNA提取试剂盒，购于美国Axygen公司；Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser，购于宝生物工程（大连）有限公司产品；猪伪狂犬病毒（gB基因）实时荧光PCR检测试剂盒，购于北京世纪元亨公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒，购于北京世纪元亨公司。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA病毒-勃林格蓝耳疫苗消毒药降解核酸效果试验。将11种常规消毒剂与RNA病毒勃林格蓝耳疫苗按40 mL消毒药+400 μL疫苗的比例混合，模拟日常消毒过程，设置蒸馏水与疫苗等比例混合为对照组。消毒药剂与RNA病毒反应时间分别为10 min、30 min、1 h、6 h、24 h 和 48 h，每个反应时间段内试验重复2组，加入IPC（内部阳性质控品）全程控制试验过程，排除残留消毒药对核酸提取及PCR反应造成的影响，筛选出消毒药剂最适消毒效果反应时间及消毒最佳药剂配比。

1.2.2 DNA病毒-海博莱伪狂犬疫苗消毒药降解核酸效果试验。将11种常规消毒剂与DNA病毒海博莱伪狂犬疫苗按40 mL消毒药+400 μL疫苗的比例混合，模拟日常消毒过程。其余步骤同1.2.1。

1.2.3 病毒核酸提取。取200 μL上述产物，按病毒RNA/DNA提取试剂盒说明，提取各试验组病毒核酸。

1.2.4 荧光定量PCR检测。使用实时荧光RT-PCR检测试剂盒进行核酸检测。操作步骤严格按照各试剂盒说明书进行。猪蓝耳病疫苗检测采用猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒；伪狂犬病疫苗检测采用猪伪狂犬病毒（gB基因）实时荧光PCR检测试剂盒。

1.3 结果统计

按照以上步骤，重复处理各组样品2次并检测，统计平均Ct值。将各组检测结果分别与对应阳性对照组比较，筛选出对核酸降解有效的消毒剂。

2 结果与分析

11种消毒剂对两种病毒疫苗核酸降解效果的荧光定量PCR检测结果如表1和表2所示。由表1和表2可知，84消毒剂、二氯异氰尿酸钠、杜邦卫可及微酸电解水均可100%降解RNA及DNA病毒核酸；不同浓度的NaOH可100%降解RNA病毒核酸，对DNA病毒核酸无效；维特利剑、戊二醛、洁净及酒精对病毒核酸降解作用不明显。

表1 RNA病毒-勃林格蓝耳疫苗（1头份）荧光定量PCR平均Ct值

表2 DNA海博莱伪狂犬疫苗（1头份）荧光定量PCR平均Ct值

3 讨论

猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病、猪流行性腹泻病和猪圆环病毒2型等都是猪群中传播较为广泛的传染性疾病，长期以来给养猪业造成了严重的经济损失[4-5]。再加上规模化养猪场的饲养密度过大以及频繁引种，更加重了疾病的传播。消毒的主要目的是通过消灭传染源和切断传播途径，阻止疫病的发生及蔓延，进而降低养殖场经济的损失[6]。消毒剂的正确使用是预防养猪场病原感染和疫病暴发的关键。本试验的创新点在于以蓝耳病毒和伪狂犬病毒疫苗为试验模型，评价常用的11种消毒剂对2种病毒的核酸降解效果，为养猪场及其他家畜养殖场的消毒程序提供理论依据。在利用荧光定量PCR检测结果作为检验农场洗消效果的大背景下，有效地为农场筛选出能够降解核酸的消毒剂，为科学评价洗消效果和降低生物安全风险提供科学依据。

近年来，随着我国规模化猪场的不断兴起，越来越多的集团化企业开始自建实验室，用于农场生物安全的风险评估和疾病预警。随着实验室的不断增加，核酸污染防控问题也越来越受到管理人员的重视。尤其对于进行PCR诊断的实验室来说，污染防控是直接影响检测结果的重要因素。因此，我们进行了常见消毒剂的核酸降解评估。通过试验结果可以看出，氯制剂（84消毒剂、二氯异氰尿酸钠、杜邦卫可及微酸电解水）对核酸降解效果明显，这可以帮助实验室管理人员进行正确的消毒药品筛选和使用，有效控制PCR检测实验室的核酸污染问题，提高检测的准确性，同时也为实验室消毒程序的制定提供科学依据。