膝骨关节炎诱导性动物模型研究进展

余绍涌，周建飞，庞向华

（柳州市中医医院/柳州市壮医医院，广西 柳州 545001）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）又称老年性骨关节炎，有文献统计，随着社会老龄化进程加快，60岁以上的人群通过X 线检查，有超过一半的人有骨关节炎影像学表现，超过35%的人有临床症状［1］。膝骨关节炎消耗了巨大的社会医疗资源，但其具体发病机制仍尚未明确。受限于伦理道德的审查，一些研究方案不能在临床上实施，而基于动物模型的实验研究可深入研究其发病机制及治疗方法，可见动物模型是研究KOA 疾病发展的重要工具。膝骨关节炎的动物模型分为自发性和诱导性两类，自发性动物模型最接近人类KOA 的自然演变过程，是研究人类KOA 的理想模型，但由于造模时间长、稳定性差，一般不作为实验研究的首选。诱导性动物模型具有造模时间短、成功率高、稳定性好、针对性强的特点，被广泛地应用于实验研究中。诱导性动物模型通过各种方式方法诱导实验动物的膝关节发生KOA病理改变，主要分为手术诱导和非手术诱导。本文就KOA 的诱导性动物模型的研究近况作一综述。

1 实验动物选择

KOA 病理改变主要表现为关节软骨损伤、软骨下骨改变、滑膜炎症、关节囊增生及骨赘形成等，对其病理改变的复制是KOA动物模型建立的关键，也是评价动物模型是否成功的标准。选择合适的动物作为KOA 模型是实验开始的第一步，也是实验成功最重要的一步。目前用于研究膝骨关节炎的实验动物较多，根据其体型大小，大体上可分为小型、中型和大型动物。小型动物价格低廉，饲养方便，但其解剖学、组织学和生理学等方面与人类差异很大。小型动物以鼠类为主，比如小鼠、大鼠、Hartley豚鼠、C57黑鼠等。小鼠常被用于遗传学相关研究［2］，大鼠常用于软骨相关的研究［3］，Hartley 豚鼠和 C57 黑鼠常被作为自发性KOA 模型进行研究［4-5］。兔类是中型动物的代表，因其饲养简单、性格温顺、体型适中、便于取材，广泛应用于各种KOA 的研究［6-8］。大型动物以狗、猪、羊、马为主［9-11］，其体型大，膝关节与人类相似度较高，也易于造模，但价格昂贵、饲养成本高、疾病进展缓慢、观察周期长等缺点限制了其实验应用。其它大型动物如短尾猴、猕猴、食蟹猴等灵长类动物，其基因组与人类高度相似，其膝关节的生理结构和病理学改变与人类最为相似，但受来源和伦理的限制，目前应用较少［12］。选择哪一动物作为自己课题的实验动物，研究者应综合考虑研究目的、实验方案、饲养难度、伦理法规和经费等问题，选择最适合的实验动物。

2 造模方式选择

2.1 手术诱导

2.1.1 Hulth法 Hulth法是建立膝骨关节炎动物模型的经典方法，通过切除实验动物的膝关节交叉韧带、内侧副韧带及内侧半月板以达到破坏膝关节生物力学平衡的目的，是基于力学机制的改变方面进行造模。Hulth 法分为传统Hulth 法与改良Hulth 法。张陆等［13］采用传统 Hulth 法对大鼠进行造模，术后 1 周后对大鼠进行运动训练以缩短造模时间，最后与假手术组相比，模型组大鼠膝关节发生变形，膝关节直径差值明显增大（P＜0.05）、膝关节腔Kellgren-Lawrence 分级也明显降低（P＜0.05）。樊燕鑫等［14］采用改良Hulth法，切断前交叉韧带并摘除内侧半月板，术后将大鼠放在湿度＞70%的环境中活动，大鼠膝关节的组织病理结果显示关节软骨面接近剥脱，透明软骨几乎全部糜烂，软骨下骨暴露，局部可见软骨下骨增生。张媛媛等［15］采用改良Hulth法造模，模型组的关节软骨HE染色显示软骨完整性破坏，表面粗糙，层次结构紊乱，可见纤维化变性及软骨缺损，并且模型组膝关节滑膜组织中的白介素1（IL-1）水平明显升高。Hulth 法通过手术的方式导致实验动物的膝关节极度不稳定，从而诱发膝骨关节炎改变，适用于中晚期膝骨关节炎的实验研究。Hulth 法具有诱导率高、稳定性好的优点，但该方法对操作者的手术技术要求较高，可能会造成手术本身对关节软骨的直接损害，且手术后也具有一定的感染概率。

2.1.2 前交叉韧带切断法 相比较Hulth 法，前交叉韧带切断法单纯地切断前交叉韧带，破坏的膝关节结构少，操作也相对简单。罗安玉等［16］通过抽屉实验阳性来确定造模成功，5 周后大鼠的膝关节软骨严重侵蚀，显微CT 提示胫骨内侧的骨小梁厚度和骨密度明显高于外侧，内侧胫骨平台后部的软骨下骨出现重塑。白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是促进软骨基质降解和关节软骨破坏最重要的细胞因子，其剂量与效应呈正相关［17］。转化生长因子-β1（TGF-β1）可刺激软骨细胞的分化和基质合成，其剂量与效应呈负相关［18］。陈益丹等［19］研究发现，采用前交叉韧带切断术造模8 周后，模型组血清中具有软骨破坏作用的IL-1β、TNF-α 与具有一定软骨修复作用的TGF-β1水平均较正常组明显升高，成功模拟了膝骨关节炎的早中期病变阶段。有研究显示即使对断裂的前交叉韧带进行重建手术，10 年后，有超过一半的患者的同侧膝关节出现KOA影像学表现，几乎是对侧膝关节的四倍［20］。

2.1.3 半月板切除法 半月板通过增加股骨与胫骨的有效接触面积以增加膝关节的稳定性，还具有缓冲压力、润滑关节的作用。祁雷等［21］研究发现切除半月板的模型组在造模术后4 周，大鼠的内侧胫骨平台软骨面变得粗糙、失去光泽，造模术后6周内侧胫骨平台形成糜烂并伴有骨赘生成，造模术后8 周则出现关节面溃疡剥脱并伴有大量骨赘形成，并且蛋白免疫印迹法结果显示，与假手术组比较，模型组各阶段的基质金属蛋白酶 13（MMP-13）及 ADAMTS-5 蛋白表达明显升高（P＜0.05），成功复刻了KOA 病变的早、中、晚期各阶段病理特征。

2.1.4 静脉结扎法 静脉结扎术是通过切断或结扎关节外主要供血血管，以减少骨内动脉灌注，阻碍静脉回流，使骨内的血流动力学发生改变，滑膜因关节内高压而血流量减少，从而影响软骨组织的营养供给，诱发软骨退变的方法。戴七一等［22］结扎并切断臀下静脉、股静脉和大隐静脉，造模后8周可见膝关节面粗糙、软骨缺损及骨赘形成，成功模拟KOA 早中期的病理改变。此种造模方法亦可用于中医学气滞血瘀证膝痹的研究。

2.1.5 卵巢切除法 卵巢切除术通过切除实验动物的卵巢模拟绝经期妇女或骨质疏松的老年人的KOA进程。雌激素可作用于关节软骨或软骨下骨，切除卵巢通过影响雌激素及其类似物的生成代谢来诱发KOA。孙光华等［23］研究发现，切除卵巢的模型组的骨体积分数、骨小梁厚度及骨小梁数量明显降低，关节软骨表面粗糙，细胞结构排列紊乱。付超等［24］通过摘除双侧卵巢诱导大鼠形成KOA，发现雌激素的缺乏将导致具有促进软骨细胞增殖、分化的Notch 信号表达下降，基质金属蛋白酶1（MMP-1）和IL-1β 表达升高，加速软骨细胞和基质的破坏。

2.1.6 软骨损伤法 软骨损伤法是手术诱导中操作相对简单的一种，也是损伤最小的一种，采用软骨损伤术造模可以直接观察实验动物关节软骨损伤后膝关节退行性改变的全过程。张凯彬等［25］在大鼠股骨髁负重区域划痕软骨2 次，未损伤到软骨下骨，观察到划痕周围软骨有软化和纤维化改变，HE 组织学染色见部分凋亡坏死的软骨细胞，改良组织学评分无明显变化，说明损伤的软骨未得到明显的修复。段鑫等［26］比较了软骨刮除与内侧副韧带切断加半月板切除法制备KOA 模型的差异，术后16 周MRI 结果显示相对于内侧副韧带切断加半月板切除组，软骨刮除组的关节面不连续，刮除部位有明显的软骨缺口，成功制备了KOA模型。

2.1.7 关节应力改变法 膝关节的稳定由各组成骨、半月板、侧副韧带、髌韧带、前后交叉韧带以及周围的肌肉组织共同维持，其中任何一部分出现问题都会造成膝关节应力改变，从而诱发KOA，即中医学所说的筋骨失衡会导致膝痹。上述几种手术方法均是通过改变膝关节的解剖结构以导致膝关节应力失衡来诱发KOA，有研究者为了缩短造模时间或提高造模成功率，常常破坏多种解剖结构来造模。刘静等［27］通过切除大鼠前交叉韧带、后交叉韧带和内侧副韧带成功建立稳定的KOA 模型。有学者为了降低手术引起的创伤性关节炎对实验的影响，通过切除大鼠髌韧带内侧2/3 部分和离断内侧副韧带来破坏髌股关节的稳定性，使膝关节多呈外翻，进而建立因股骨内外侧髁受力不均而导致的膝骨关节炎模型，在一定程度上模拟了先天性股骨髁发育不良患者的KOA进程［28］。

2.2 非手术诱导

2.2.1 高脂饮食法 肥胖是KOA 发生与发展的危险因素，肥胖患者的膝关节负荷大，控制体重可以降低KOA 发生概率。宗文浩等［29］研究了高脂饮食诱导的骨性关节炎发生过程中骨关节软骨的病变，结果发现喂养高脂饮食容易导致小鼠肥胖，高脂饮食组的小鼠较正常饮食组软骨表面粗糙，甚至出现部分缺损，软骨层厚度也降低。Son 等［30］通过喂养小鼠高脂饮食，避免破坏膝关节的完整性和稳定性，成功建立了接近肥胖型人类膝关节负荷的OA模型。

2.2.2 寒冷刺激法 寒冷刺激法是将实验动物长期置于寒冷的环境中以刺激机体收缩血管，膝关节的血供随之减少以诱导软骨退变、滑膜增生、炎症因子释放，从而诱发KOA。赵林灿等［31］将大鼠每日置于6～8 ℃的冷水中1.5 h，1 个月后，大鼠膝关节红肿，关节软骨表面粗糙、不平整，软骨表层变薄，局部有裂隙缺损，酶联免疫吸附测定（ELISA）显示血清中TNF-α、IL-1β 和透明质酸含量显著升高，实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测软骨中PERK、Bip、Caspase-9的mRNA 和蛋白表达水平明显升高。结果表明寒冷刺激可诱发膝关节的炎症反应，从而激活PEAK/Bip信号通路，进而导致关节软骨退变，最终形成骨性关节炎。陈文超等［32］结合大鼠关节肿胀情况、软骨组织病理结果、血清指标及影像学表现，确认可通过寒冷刺激建立膝骨关节炎模型。

2.2.3 关节制动法 制动是骨科常用的辅助治疗方法，其通过外固定装置或材料使受损组织得到稳定的修复环境和充分的修复时间，然而长时间的制动会导致肌肉萎缩、韧带松弛和软骨细胞凋亡，从而诱发KOA。田育魁等［33］用高分子绷带和塑料杆将兔的膝关节固定在75°左右，持续固定8 周后成功观察到KOA 病理学改变。黄旭东等［34］采用伸直位固定使兔膝关节长期保持负重位，2周后膝关节软骨退变明显，关节间隙变窄，周边出现大量骨赘，符合膝骨关节炎改变。中医认为，痹者，屈伸不利。关节制动法是从症状导向病因的诱发模型，可以较好地模拟膝痹的瘀血闭阻证病机，操作也简单，但也存在不足，如外固定松动、破损甚至脱落，实验动物的肢体出现肿胀、皮肤破损等。

2.2.4 关节撞击法 相对于关节制动法的造模长时间较长，关节撞击法相对简单直接，同时也是非侵入性操作，其通过外部施加机械负荷模拟人类创伤后引起的膝关节病变。Furman 等［35］用定制的压头尖端撞击小鼠的胫骨平台导致膝关节内闭合性骨折，最后通过组织学和显微CT 评估确定小鼠膝关节软骨下骨增厚等病理改变为骨关节炎样改变。有学者［36］将小鼠的右膝置于过度弯曲的位置，然后撞击胫骨，诱导小鼠膝关节软骨细胞凋亡，软骨基质降解，软骨胶原纤维排列紊乱，血清软骨寡聚基质蛋白水平升高，成功复制了KOA模型。

2.2.5 关节腔注射法 关节腔注射法是将化合物直接注射到实验动物的膝关节腔内，改变膝关节的内环境以诱发KOA，因操作相对简便、造模时间短和成功率高，是除手术诱导外最常用的诱导方法，可以观察到KOA 软骨终末期的病理改变，适用于软骨病理、药物防治方面的研究。常用药物有木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶、碘乙酸盐等。

木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶，通过降解软骨中的蛋白聚糖、影响细胞外基质中的蛋白多糖而破坏胶原蛋白的整合来诱发KOA。黄云梅等［37］从大鼠膝关节髌韧带附着点的外上方向关节腔内注射4%木瓜蛋白酶溶液0.2 ml，1 周后模型组血清和关节液中 IL-1β 和 TNF-α表达水平明显升高，MRI 提示关节液增多、滑膜增生，成功建立了早期KOA 模型。赵露婷等［38］采用木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合溶液造模，2 周后模型组的兔膝关节软骨出现缺损、侵蚀、溃疡，软骨细胞减少，潮线被破坏，骨赘形成，并有大量关节积液。

胶原蛋白酶通过分解软骨细胞间基质的胶原蛋白引起关节不稳来诱发KOA。Utomo 等［39］发现关节腔内注射胶原酶可以使半月板和关节软骨损伤，从而成功建立KOA 模型。王朝强等［40］通过观察犬膝关节X 线、MRI 检查、组织病理学检查结果，发现关节腔内注射Ⅱ型胶原酶和石膏制动法均可成功制备KOA 动物模型，关节腔内注射法造模时间更短，主要表现为早期膝骨关节炎病理改变，关节制动法更加符合中晚期膝骨关节炎病理改变。

碘乙酸盐能抑制糖酵解，导致细胞外基质蛋白聚糖合成的数量和质量下降，从而引起软骨细胞凋亡［41］。有学者比较了用木瓜蛋白酶、碘乙酸钠和Ⅱ型胶原蛋白酶造模对大鼠膝关节行为学、细胞因子和病理的不同影响，发现碘乙酸钠在关节注射次数、膝关节病理这两方面优于木瓜蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶［42］。肖昆林等［43］用2 mg的单碘乙酸对大鼠进行关节腔内注射，造模2 周后出现早中期KOA 软骨退变的表现，4 周后出现晚期的软骨退行性变的表现。王宝娟等［44］研究了不同剂量的碘乙酸钠对家兔膝关节的影响，通过HE 染色及骨性关节炎组织病理学评分（Mankin 评分）观察各组软骨的病理改变，发现7.5 mg/kg剂量的碘乙酸钠才能成功建立早期KOA模型。

王维山等［45］向家兔膝关节中注射尿激酶型纤溶酶原激活物，家兔膝关节随后出现软骨表面缺损、软骨细胞数目明显减少及潮线破坏等软骨损伤的病理现象。有学者［46］成功采用瘦素诱导KOA 模型，其诱导机制涉及到基质金属蛋白酶、炎症因子、生长因子、凋亡基因和成骨相关的基因表达的调控。

2.2.6 基因工程法 转基因模型是通过转基因技术结合基因编辑技术等将外源基因插入动物基因组或对动物自身基因进行突变、敲除以转变实验动物的基因来诱发KOA 的动物模型，为KOA 造模研究提供了新的选择。有研究发现，敲除Del1基因让软骨细胞对凋亡的敏感性增强，更容易出现骨关节炎，并且一旦出现将会是更严重的骨关节炎［47］。Xie 等［48］通过转基因工程得到Pten 缺失小鼠，小鼠膝关节软骨细胞中Akt 信号的紊乱触发氧化应激诱导的软骨细胞衰老，从而引起KOA。虽然通过基因工程法能够成功建立KOA 模型，但其发病机制是由于基因异常引起的，与人类KOA的发病机制是否一致还存在一定的争议。

3 总结与展望

膝骨关节炎的发病机制复杂，一般认为是多种因素联合致病，建立理想的动物模型是研究KOA的实验基础，也是实验结果真实有效的保障。综上所述，造模方法很多，每种方法都有不同的造模周期、适用范围和优缺点。比如关节内的手术诱导成模率高、复制性强、可控性好，最适用于观察创伤性KOA 不同阶段的大体和病理特点的研究，但因存在手术创伤，需要注意避免感染等手术并发症；关节制动法避免了创伤带来的炎症介质的释放，最适合膝关节软骨变化或炎症递质表达的研究，但其具有外固定容易松动、脱落，实验动物皮肤易破损等缺点；关节腔内注射药物诱导造模时间短、操作简便、不良反应少，最适用于KOA药物筛选、对比及疗效的研究，但不适合人类代谢性KOA 和创伤性KOA 的研究；因此，研究者应根据实验研究的实际需要，结合各种动物模型的特点，选择最合适的造模方法。值得一提的是，笔者通过综述文献，发现当前绝大多数KOA模型都是根据现代医学的病理病因进行造模，中医药动物模型甚少，唯有寒冷刺激法、关节制动法和静脉结扎法等结合了中医证候的病因或诱因。中医药从整体辨证论治，治疗膝痹具有独特的优势，在现代医学建模基础上施加中医病因建立病证结合的动物模型将是人们进一步研究KOA病因病机以及药物防治的重要方向。