亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与原因不明复发性流产的关系

宫艳艳，王 莉，陈 苗，迟 洁

(陕西省人民医院检验科，陕西 西安 710068)

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指3次及3次以上妊娠28周之前的临床妊娠丢失[1]。RSA病理原因较为复杂，主要包括精神、感染、免疫、血型不合、解剖、内分泌和染色体因素等，但仍有约50%RSA患者病理原因不明，被称为原因不明复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[1]。叶酸是胚胎发育中的主要营养素，有研究显示，URSA与叶酸代谢相关酶基因突变密切相关[2]。同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)具有胚胎毒性，叶酸代谢过程可为HCY转化为甲硫氨酸提供甲基载体[3]。亚甲基四氢叶酸还原酶(metylene tetra hydro folate reductase，MTHFR)是影响机体叶酸和HCY代谢的主要蛋白酶之一。MTHFR基因多态性可影响催化活性，主要为C677T位点、A1298C位点的单核苷酸多态性[4]。基于此，本研究旨在探讨MTHFR基因C677T位点、A1298C位点多态性与URSA的关系，以期为降低URSA的发病风险提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017年1月至2020年1月陕西省人民医院收治的URSA患者为研究对象。病例纳入标准[5]：(1)自然流产次数≥3次；(2)甲状腺功能正常；(3)基础体温呈双相，排卵及月经周期正常；(4)经子宫及其附件造影和多普勒超声检查明确生殖器正常；(5)夫妻双方外周血染色体核型分析正常。排除标准：(1)近3个月内接受维生素补充治疗者；(2)有糖尿病、静脉栓塞和家族遗传病史；(3)合并单纯疱疹病毒、梅毒螺旋体、巨细胞病毒、弓形虫、衣原体、支原体感染者；(4)患有肝肾疾病者；(5)抗精子抗体、抗磷脂抗体、抗核抗体等免疫相关抗体阳性者。另选择同期行孕前检查的健康非妊娠妇女为对照组。对照组纳入标准：成功妊娠史≥1次；排除标准：有血栓性疾病、宫内死胎、胎儿生长受限、胚胎停育、自然流产、妊娠高血压综合征史[5]。本研究共纳入URSA患者125例(URSA组)，年龄 21～47(32.23±6.11)岁。对照组受试者123例，年龄20～46(32.15±6.28)岁。2组受试者的年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测MTHFR基因C677T位点、A1298C位点基因型使用无菌棉拭子在2组受试者口腔内侧刮拭40次以上，以略鼓起为适宜，采集口腔黏膜上皮细胞，使用核酸提取试剂盒(西安天隆科技有限公司)提取DNA。使用商品化MTHFR基因C677T、A1298C位点扩增试剂盒(西安天隆科技有限公司)进行基因型检测。PCR反应体系30 μL：Taqman-MGB 探针0.5 μL，Taqman Universal Master Mix 5 μL，20 mg·L-1DNA模板1 μL，上、下游引物各2 μL，去离子水补至30 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火延伸30 s，共45个循环。使用荧光定量 PCR 仪及其软件Gentier 96E分析基因分型。

1.2.2 MTHFR酶活性检测采集2组受试者静脉血5 mL， 4 ℃下3 500 r·min-1离心 15 min，收集血清。使用MTHFR酶联免疫试剂盒(上海梵态生物科技有限公司)和酶标仪(日本Toshiba公司)检测2组受试者血清中MTHFR酶活性，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 酶联免疫吸附测定法检测血浆HCY水平

采集2组受试者空腹静脉血5 mL，加入乙二胺四乙酸二钾抗凝真空采血管中，充分混匀，并于40 min内3 500 r·min-1离心15 min，立即分离血浆，置于-20 ℃保存备用。使用酶联免疫吸附测定试剂盒(日本Toshiba公司)和全自动生物化学分析仪(日本Toshiba公司)检测血浆HCY水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 2组受试者MTHFR酶活性和血浆HCY水平比较结果见表1。URSA组受试者的MTHFR酶活性显著低于对照组，血浆HCY水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 2组受试者MTHFR酶活性和血浆HCY水平比较

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验URSA组和对照组受试者MTHFR基因C677T位点、A1298C位点的基因型频率均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律(P>0.05)，2组受试者均为遗传平衡群体。

2.3 2组受试者MTHFR基因C677T位点基因型及等位基因分布比较结果见表2。2组受试者MTHFR基因C677T位点均存在TT、CT、CC 3种基因型及C、T 2种等位基因。与对照组比较，URSA组受试者MTHFR基因C677T位点TT基因型频率显著升高，CT基因型频率显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。2组受试者 MTHFR基因C677T位点CC基因型频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。URSA组受试者的MTHFR基因C677T位点T等位基因频率显著高于对照组，C等位基因频率显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 2组受试者MTHFR基因C677T位点基因型及等位基因分布比较

2.4 2组受试者MTHFR基因 A1298C位点基因型及等位基因分布比较结果见表3。2组受试者MTHFR基因A1298C位点均存在CC、AC、AA 3种基因型及C、T 2种等位基因。2组受试者的MTHFR基因A1298C位点的CC、AC、AA基因型频率及C、A等位基因频率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3 2组受试者MTHFR基因A1298C位点基因型及等位基因分布比较

2.5 2组受试者MTHFR基因C677T位点、A1298C位点基因型与URSA患病风险的相关性分析结果见表4和表5。以基因型为自变量，以是否发生URSA为因变量，进行logistic回归分析，结果显示，MTHFR基因C677T位点TT基因型携带者发生URSA的风险显著高于CC基因型携带者，差异有统计学意义(P<0.05)；MTHFR基因C677T位点CT基因型与CC基因型携带者的URSA发生风险比较差异无统计学意义(P>0.05)。MTHFR基因A1298C位点CC、AC、AA基因型携带者的URSA发生风险比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 2组受试者MTHFR基因 C677T位点基因型与URSA患病风险的相关性

表5 2组受试者MTHFR基因A1298C位点基因型与URSA患病风险的相关性

3 讨论

目前，URSA的治疗效果欠佳，因此，对于URSA的病因和治疗手段的研究非常重要。MTHFR是调节机体HCY和四氢叶酸代谢的主要蛋白酶，编码MTHFR的多个基因多态性位点，被证实与URSA的发生发展密切相关[6]。本研究结果显示，与对照组比较，URSA组受试者MTHFR基因C677T位点TT基因型频率显著升高，CT基因型频率显著降低，T等位基因频率显著升高，C等位基因频率显著降低，而2组受试者的MTHFR基因A1298C位点的CC、AC、AA基因型频率及C、A等位基因频率比较差异均无统计学意义；此外，logistic回归分析显示，MTHFR基因C677T位点TT基因型携带者发生URSA的风险显著高于CC基因型携带者(3.025倍)，MTHFR基因A1298C位点CC、AC、AA基因型携带者的URSA发生风险比较差异无统计学意义；提示MTHFR基因C677T位点多态性与URSA的发生存在关联，而MTHFR基因A1298C位点多态性与URSA无关，这与李华等[7]研究结果一致。华知奋等[8]通过比较143名健康妇女和140例URSA患者MTHFR基因C677T、A1298C位点基因多态性发现，MTHFR基因多态性与URSA无关，这可能与研究对象所在区域和样本量具有一定的关系。

孙玉秀等[9]研究表明，MTHFR多态性与妊娠期妇女血液高凝状态具有紧密的关系，且MTHFR基因突变可能与URSA具有相关性。本研究结果显示，URSA组受试者的MTHFR酶活性显著低于对照组，血浆HCY水平显著高于对照组，提示MTHFR基因多态性可能会通过影响HCY转化而影响URSA的发生发展，原因可能为URSA患者的MTHFR 酶活性降低导致机体叶酸代谢障碍，HCY水平增高，从而促进血液高凝状态的形成，增加胎盘栓塞所致URSA的风险，且HCY具有的胎盘毒性可能会增加胚胎发育障碍所致URSA的风险[10]。对于由MTHFR遗传因素引起的URSA，可为患者提供叶酸治疗，有利于降低血浆HCY水平，降低妊娠期血栓性疾病的风险，改善下一次妊娠结局[11]。临床可通过检测MTHFR基因C677T位点基因型指导孕前、孕期补充叶酸，以降低URSA的发生风险[12]。关于如何准确掌握叶酸的用药剂量和时间及减小滥用叶酸对妊娠期妇女和胎儿的负面影响，尚需进一步的研究探讨[13]。

URSA患者在排除血栓、内分泌、免疫、环境、感染、遗传和解剖学等病因后，应考虑MTHFR基因筛查，对于合并MTHFR基因C677T位点基因突变的患者应实施个性化的叶酸补充治疗，且需持续监测血浆HCY水平，对于血浆HCY水平异常升高者可通过补充大剂量叶酸、维生素B12、维生素B6等药物干预，以便改善下一次妊娠结局。URSA是环境和多基因相互作用的最终结果，且由于血浆HCY的检测费用低廉，而MTHFR 的检测费用较高，MTHFR基因型检测可否替代血浆HCY水平检测而成为常规检查方法尚需进一步加大样本研究，临床上需结合考虑多种因素以明确MTHFR 基因多态性及HCY与URSA之间的确切关系。

综上所述，MTHFR基因A1298C位点多态性与URSA无关，MTHFR基因C677T位点多态性与URSA的发生存在关联；MTHFR基因C677T位点TT基因型携带者具有较高的URSA发生风险，可能与降低MTHFR酶活性导致机体叶酸代谢障碍、HCY水平升高有关。