等离子体活性水腌制对风干里脊中生物胺含量及感官品质的影响

罗 辑，戴照琪，赵 航，章建浩

（1.安徽师范大学生命科学学院，安徽 芜湖 241001；2.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095；3.江苏农林职业技术学院茶与食品科技学院，江苏 句容 212400）

等离子体活性水（plasma-activated water，PAW），是通过等离子体处理溶液后产生，又指等离子体酸、等离子体活性液[1]。PAW加工方便、安全、效率高、成本低，包含很多活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮（reactive nitrogen species，RNS）、电子、离子等活性物质，可以通过介质阻挡放电（dielectric barrier discharge，DBD）系统，等离子体射流装置等形式的等离子体制备[2]（图1）。PAW中寿命相对较长的二次产物，如过氧化氢、臭氧、硝酸盐和亚硝酸盐等活性物质可有效抑制热敏食品中微生物的生长[3]。

图1 等离子体活性水产生方式Fig. 1 Schematic diagram of PAW generatio n

PAW作为一种新型食品加工技术，最早应用于肉制品的杀菌保鲜[4]。近年来在肉品加工中也开始应用研究，在肉制品的加工过程中，腌制是风干里脊加工的关键步骤，PAW腌制可能会影响风干肉制品的蛋白氧化水解和脂质的氧化的程度，从而影响风干肉制品的感官品质。Hae等[5]用DBD处理盐水腌制猪肉后加工成肉脯，发现DBD处理盐水对猪肉脯有杀菌作用，并能改善猪肉脯加工中腌制颜色的形成。Jung等[6]对比PAW、芹菜粉和亚硝酸钠制备的乳化肠，发现利用低温等离子体处理过程中产生的RNS与水发生反应可产生天然亚硝酸盐，且经PAW加工的乳化肠与亚硝酸钠处理的样品在颜色、味道、风味和可接受性等感官特性上没有差别，比添加23 g/kg芹菜粉加工的样品有更好的味道和可接受度。将PAW作为亚硝酸钠的替代品应用于火腿肠生产中，产品的亚硝酸盐残留量明显低于亚硝酸钠处理后的残留量，经Ames实验证明PAW生产的火腿肠无基因毒性[7]。Kim等[8]利用不同气体成分作为填充气体，用DBD处理新鲜猪里脊，发现DBD处理的新鲜里脊感官质量（外观、颜色、气味、可接受性等）显著降低，但是经过煮制后，感官评价与未处理组没有差异。因此，等离子体技术作为一种非热杀菌和腌制方法，在肉制品加工业中应用前景广泛。

生物胺是肉制品中很常见的一类碱性含氮物，常见的有色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺8种[9]。风干肉制品中生物胺的产生主要由于氨基酸脱羧酶阳性细菌产生的脱羧酶促进氨基酸脱羧，导致生物胺积累。酪胺和组胺具有毒性，是致突变剂的前体物质，腐胺、尸胺、精胺也会与亚硝基化合物产生致癌性的N-二甲及亚硝胺、N-亚硝基吡咯烷和N-亚硝基哌啶[10]。低温等离子体技术处理后不产生残留物或有毒分子，已经被证明可以成功地用于新鲜食品的灭菌，延长保质期[3]。但有关低温等离子体加工技术对风干肉制品中生物胺形成的影响研究鲜有报道，因此，研究PAW处理对肉制品中生物胺指标的影响具有重要意义。

本实验首先进行PAW的制备，以猪里脊为原料，利用PAW腌制后采用强化高温成熟技术制备风干里脊。研究PAW腌制对风干里脊pH值、亚硝酸盐残留量、生物胺含量和感官品质的影响。旨在研究PAW作为亚硝酸盐来源在肉制品加工中的适用性安全性，为等离子体技术在猪肉制品中应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从市场（南京市）随机购买太湖黑猪肉背长肌（longissimusmuscle），剔除多余脂肪，切成10 mm厚，10 cm×10 cm大小的肉块，真空包装后在4 ℃冰箱冷藏过夜。

色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺、丹磺酰氯 美国Sigma公司；乙腈、丙酮、二氯甲烷（均为色谱纯） 上海阿拉丁试剂有限公司；磺胺、N-(1-萘基)-乙二胺盐酸盐、亚硝酸钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂北京有限公司。

1.2 仪器与设备

BK130/36介质阻挡等离子体发生器 美国Phoenix公司；T25高速匀浆机 德国IKA公司；UV-2501分光光度计 日本岛津公司；J-6M高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司；5415D高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Testo230型pH计 德国Lenzkirch公司；BSC-250恒温恒湿箱 上海博迅实业有限公司；PEN3电子鼻系统 德国AirSense公司；Alliance 2695液相色谱仪美国Waters公司；XDB-C18色谱柱 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 PAW制备

根据Luo Ji等[11]的方法稍加修改，吸取200 mL去离子水加入聚丙烯包装盒内（178 mm×126 mm×35 mm），用聚酰胺/聚乙烯复合膜热封包装。将密封包装盒置于两个直径为150 mm的环形铝电极中间，在包装盒上部和下部分别安装聚丙烯面板作为绝缘屏障，距离为40 mm。采用直接处理的方式处理去离子水，工作电压分别为50、60、70 kV，处理时间3 min。本研究处理条件是根据空气击穿的Paschen曲线[12]和预实验结果的基础上选取。当处理电压超过75 kV时，DBD系统经常发生飞弧。在DBD系统中，输出电压由高压探头（Tektronix nc., P6015A, USA）和数字示波器（Tektronix Inc., 2024C,USA）确定，放电电流采用传统电流监视器（Pearson Electronics, 2877, USA）观察。当输出电压为50、60、70 kV时，电流分别为0.7、0.8、0.9 mA，输出功率分别为35、48、63 W。DBD系统的工作频率为50 Hz。所有处理均在没有空气循环或补充任何其他特定气体的大气压力环境中进行。在DBD处理过程中，下部的电极与水样品之间的距离为2 mm，最小的放电间距为10 mm。所有处理均在相对湿度（40±5）%和（20±2）℃下进行，处理结束时，PAW温度均不超过35 ℃，制备后的PAW在4 ℃冰箱冷藏2 h。

1.3.2 风干里脊样品加工

腌制液的制备：在PAW溶液和纯水中分别加入NaCl，配制成6% NaCl的腌制液。将冷藏过夜的里脊随机分成4 组，其中一组用未处理组腌制液腌制，为对照组（n＝10），另3 组分别为50、60 kV和70 kV电压处理条件制备的PAW处理组（n＝90）。每组样品在10 ℃环境中腌制24 h，腌制液和肉块的质量比为2∶1。腌好后风干成熟15 d。根据之前的方法稍加修改[13]，其间温湿度程序为起始温度12 ℃、环境相对湿度80%，然后随着风干成熟时间进行温湿度设定（每天温度升高2 ℃、相对湿度每天降低2%），最终温度和相对湿度分别为37 ℃和65%。在加工结束后，每组随机抽取5 份风干里脊样品（每份约50 g），将每块里脊切碎、混匀，真空包装后在-40 ℃冷冻贮藏备用。每组实验重复3次。

1.3.3 亚硝酸盐残留量测定

采用Dalia等[14]的方法并稍作修改，利用分光光度法测定样品中亚硝酸盐的含量。具体如下：将5 g样品与40 mL热水（80 ℃）在烧杯中充分混合后，转移到500 mL容量瓶中，用连续的热水将烧杯彻底清洗，将所有洗涤物加入容量瓶中。随后加入足够的热水使体积达到300 mL左右，然后进行蒸汽浴2 h，间歇摇动，然后冷却，过滤，必要时离心。在滤液中加入50 mL 10 g/L磺胺，室温下混合5 min后与50 mL 1.0 g/LN-(1-萘基)-乙二胺盐酸盐混合20 min待显色。充分溶解后亚硝酸盐浓度利用分光光度计在波长540 nm处测定吸光度。通过与标准曲线比较，测定亚硝酸盐的残留量。

1.3.4 风干里脊pH值测定

将风干成熟后的里脊样品（5 g）与5 倍体积蒸馏水用高速分散机10 000 r/min匀浆1 min，匀浆后使用pH计测量匀浆的pH值，每组测定重复3次。

1.3.5 风干里脊中生物胺含量测定

1.3.5.1 生物胺标准溶液配制与柱前衍生

根据魏延玲等[15]方法并稍作改进。精确配制色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺8种生物胺的梯度标准溶液，使其质量浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL。取标准溶液1.0 mL，首先加入2 mol/L NaOH 200 μL制成碱性溶液，接着用300 μL饱和NaHCO3溶液缓冲，最后加入2.0 mL 10 mg/mL的丹磺酰氯丙酮溶液在40 ℃下避光反应40 min后，用100 μL 25%的氨水停止反应，静置30 min，用乙腈定容至5 mL，溶液用0.22 μm滤膜过滤待测。

取5 g样品搅碎，将肉糜加入到20 mL 0.4 mol/L的HClO4溶液中进行匀浆（10 000 r/min，1 min），将制得的悬浮液放入超声波中提取30 min后进行高速冷冻离心（3 000×g，10 min，4 ℃），将沉淀用相同的方法再提取1次，收集2次上清液合并。用相同的HClO4溶液定容至50 mL。取1 mL溶液进行柱前衍生，根据标准曲线测定生物胺含量，以mg/kg肌肉表示。

1.3.5.3 色谱条件

采用水（A）和乙腈（B）为流动相，柱温35 ℃，流动相流速1 mL/min，紫外检测波长254 nm；Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；色谱系统：Waters 2690，进样量20 μL。洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱Table 1 Gradient elution program

1.3.6 电子鼻分析PAW对风干里脊风味轮廓的影响

图2展示了常见的电子鼻检测系统结构。本实验采用商业化便携式电子鼻系统（PEN3），设备由进气单元、传感器阵列和模式识别系统组成，其对应的物质如表2所示。在操作E-nose之前，样品在4 ℃下完全解冻，切成2 mm×2 mm×2 mm的肉块，每份样品称取10 g放入250 mL玻璃烧杯中，用锡箔纸密封烧杯。将其置于30 ℃水浴条件下，平衡20 min用于消除传感器检测时的基线漂移[16]。采用顶空采样法对样品气味进行收集，检测时间为120 s，记录点默认间隔1 s，进气速率设定为0.15 L/min。传感器响应信号以电导率G/G0值进行表示，完成每个样品测量后进行120 s自然洗气，基线归零时间设为5 s，归零后G/G0值强制初始化为1。

图2 PEN3电子鼻检测示意图Fig. 2 Schematic diagram of a portable electronic nose PEN3

表2 电子鼻PEN3标准传感器陈列及其应用Table 2 Performance description of PEN3 electronic nose sensor arrays

1.3.7 感官评价

风干成熟产品，请15 位品评员（7 男，8 女，22～55 岁）参与感官评估，每一位参与感官评估的专家都至少有一年的肉类品质分析经验。在专家成员进行感官评价之前，将对照组和PAW处理的风干里脊切成20 mm×20 mm×3 mm的薄片，用于感官评价的参数包括颜色、风味、滋味、质地和可接受性。将样本放在带有随机数字的白色塑料托盘上，放在每位小组成员面前，在感官评价过程中提供水冲洗口腔。各项分数去掉极值后相加求平均值[17]。评分采用9 分制，具体评定标准见表3。

第二是日用品的改变导致的谜语费解。从前的一些日用品已经或者行将淘汰，以之为谜底的谜语就令年轻人费解，自然面临着被淘汰的命运。如例11的谜底“火钳”，例12的谜底“草鞋”，现在在城镇甚至在一些乡村都已经很难觅其踪迹了，其谜语的费解是显而易见的：

表3 感官评定标准Table 3 Criteria for sensory evaluation of air-dried meat products

1.4 数据分析

1.4.1 特征数据提取

电子鼻系统可以采集单个样品120 s内10个传感器的响应变化值，即单个样本的电子鼻数据由10×120型号矩阵组成。电子鼻在分析数据过程中，由于对原始数据特征提取的特征信息模式不同，导致所建立的化学计量模型也有差异。每个传感器所对应的响应曲线包含初始阶段、快速响应阶段和稳定阶段。

1.4.2 数据处理分析

所有不同处理组实验数据采用SPSS 18.0统计软件（SPSS Inc., Chicago, USA）进行单因素方差分析（ANOVA）。不同平均值之间利用Duncan检验进行差异显著性检验（P＜0.05）。使用SPSS 18.0软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA），所有图形绘制使用Origin 8.5软件。所有实验均随机抽取3个重复（n＝3）进行数据分析。数据表示为。

2 结果与分析

2.1 PAW腌制对风干里脊亚硝酸盐残留量和pH值的影响

与对照组相比，经PAW盐水腌制的所有样品中亚硝酸盐残留量均显著增加（P＜0.05），在50、60、70 kV处理电压下，PAW盐水腌制样品的亚硝酸盐残留量分别为8.12、10.11 mg/kg和15.24 mg/kg（表4）。结果表明，在50～70 kV处理过程中，风干里脊亚硝酸盐残留量明显增加（P＜0.05）。该结果与Jung等[6]报道的结果一致，等离子体处理强度的增加会导致肉制品中亚硝酸盐含量的增加。但PAW盐水处理后各产品的亚硝酸盐残留量均低于20 mg/kg，低于30 mg/kg肉制品中亚硝酸盐残留量的最大允许含量[18]，这也与PAW腌制降低了产品的pH值有关。对照组和PAW组在50、60、70 kV处理条件下制成的风干里脊pH值分别为6.28、5.92、5.87、5.75。研究发现当用DBD直接处理猪里脊肉后，由于DBD产生的氮氧化物和最终产品中亚硝酸盐残留水平的增加，猪里脊肉的pH值显著下降[8]。高pH值可以通过脂质氧化产生丙二醛导致亚硝胺的形成。当pH值低于6.0时，亚硝酸盐可以转变为亚硝酸和NO从而降低亚硝酸盐的残留量[9]。且相关研究证明，经PAW加工后的香肠和火腿肠中没有发现致突变性和免疫毒性[7]。

表4 PAW腌制对风干里脊亚硝酸盐残留和pH值的影响Table 4 Effect of PAW curing on residual nitrite content and pH of air-dried pork tenderloin

2.2 PAW腌制对风干里脊中生物胺含量的影响

如图3所示，采用生物胺检测方法能有效分离并检测出标准溶液的8种生物胺。样品中共检测到6种生物胺，分别为苯乙胺、腐胺、组胺、酪胺、精胺和尸胺（表5）。生物胺一般都由相应的氨基酸脱羧而成，例如鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸脱羧可分别形成腐胺、尸胺、精胺、组胺、酪胺和苯乙胺[19]。

对照组6种生物胺中含量最高的是尸胺，其次是精胺、酪胺、腐胺、苯乙胺和组胺。样品中各种生物胺的不同与各种微生物特别是腐败微生物产生的脱羧酶有关，如乳酸菌、肠杆菌、假单胞菌等，也与蛋白质降解以及各种氨基酸组成的比例相关[20]。这6种生物胺中组胺的毒性最大，酪胺次之，腐胺是食品中亚硝胺产生的底物，精胺是生理多胺，对机体代谢有功能性作用[21]。PAW处理能显著降低尸胺的含量（P＜0.05），尸胺的形成与肠杆菌密切相关，肠杆菌在肉制品风干成熟过程中能促进赖氨酸脱酸，而等离子体处理能显著降低肉制品中的肠杆菌数量[22-23]，同时PAW腌制过程中产生的亚硝酸盐、羟自由基等物质也能有效抑制微生物的生长[3]，随着处理电压的增加，尸胺含量分别显著下降（P＜0.05）8.21%、11.29%和19.49%，这可能与PAW中亚硝酸盐含量和活性物质的含量上升有关。精胺是天然存在与肉制品中的胺类物质，可以被微生物作为氮源利用而减少[24]，精胺含量在PAW处理组中分别显著（P＜0.05）下降9.64%、16.54%和27.56%，说明PAW处理能有效抑制风干里脊中精胺含量。酪胺含量在各处理组中均远低于100 mg/kg，因此在风干里脊样品中没有毒性。研究表明微球菌与组胺和腐胺的形成有关[25]，而等离子处理能对微球菌有很好的杀菌效果[26]，从而抑制微球菌产生的脱羧酶促进氨基酸脱羧产生生物胺，显著降低组胺和腐胺的含量。另外苯乙胺虽然对人体没有毒性但可以与亚硝酸盐生产N-亚硝胺，本研究中苯乙胺的含量均低于50 mg/kg，在可接受范围内。PAW处理组中生物胺含量的降低也可能与加工过程中蛋白酶活的下降有关。肠杆菌能诱导尸胺、腐胺和组胺的产生，微球菌可以引发腐胺、组胺和苯乙胺，所以等离子体对肉制品中菌落总数、肠杆、微球菌、沙门氏菌等微生物的抑制作用可以显著抑制生物胺的生成。低pH值可以抑制产生物胺脱羧酶阳性菌的活性，对生物胺的抑制有重要贡献[27]。

图3 生物胺混合标准品（A）和对照组样品（B）生物胺色谱图Fig. 3 HPLC chromatograms of mixed standard of biogenic amines (A) and control sample (B)

表5 PAW腌制对风干里脊生物胺的影响Table 5 Effect of PAW curing on content of biogenic amines in dried pork tenderloin

2.3 PAW对风干里脊响应特性的影响分析

由图4可以发现，相对电阻率（G/G0）初始阶段比较低，而在60 s内随着挥发物在传感器表面富集逐渐增大，110 s后趋于平缓，因此采用第120秒作为特征值进行数据分析。S7（硫化物）和S9（芳香成分）传感器响应值变化最为明显，特征传感器S5响应值在检测过程中持续下降，但下降幅度有限。含硫化合物中，多数呈现肉香味。部分传感器如S4、S10在整个阶段保持相对稳定，原因是它们的敏感物质分别对应氢气和烷烃。另外传感器的最低检测限也是影响信号波动的主要原因，如S7和S9传感器最低检测限可达1×10-6，对挥发性成分波动相对敏感。通过E-nose分析，可以得出E-nose对样品的挥发性成分有明显的响应，表明利用电子鼻PEN3系统检测不同腌制处理的风干里脊挥发性物质可行。

图4 电子鼻传感器对风干里脊的响应曲线Fig. 4 E-nose sensor response curves for air-dried pork tenderloin

图5 传感器对不同处理风干里脊的响应雷达图Fig. 5 Radar map of air-dried pork tenderloin with different treatments

如图5所示，加工后的产品风味特征与原料存在明显差异，且对比不同处理组风干里脊传感器信号发现，PAW处理组与CK组风味整体差异不显著，只有CK组的S8传感器信号强度明显大于PAW处理组，可能是由于PAW腌制产生的亚硝酸盐以及PAW本身对肉制品微生物的抑制作用，对照组的抑制效果相对较弱可能导致微生物的新陈代谢增加，从而生产更多的乙醇[28]。从各传感器的响应值也可以发现60 kV处理组与50 kV和70 kV处理组存在差异。具体表现为60 kV处理组的S1、S3、S5三个传感器信号强度明显大于50 kV和70 kV处理组，说明60 kV处理组在芳香类、烷烃类、烯烃类风味化合物强度明显增加。而S8和S9传感器信号显著低于其他处理组，表明乙醇和含硫化合物的强度下降。而S4、S6和S10传感器信号有所重合，可能是风干里脊的成熟时间不够充分，导致有些气味的差异不显著。

2.4 电子鼻分析PAW处理对风干肉制品风味的影响

2.4.1 PCA结果

由于每一种提取方案中，电子鼻数据包括了10 组传感器特征信号，这种抽象的数据矩阵难以被直接用于数据结构的描述，因此，使用PCA方法对数据做降维处理。通常当选取的PC累计贡献率超过85%，可视为对原始数据具有充分代表性。从图6可以看出，PC1和PC2累计贡献率为85.85%，说明PCA可以很好区分样本。从结果上看，原料肉与各处理组完全区分，表明PAW腌制后猪肉气味产生明显变化。50 kV和70 kV处理组较为接近，表明这2个处理组的气味无显著差异，但60 kV处理组与CK组和其他PAW处理组完全区分，说明60 kV处理组风干里脊的风味与其他3 组可能有显著不同，而50 kV和70 kV处理组与CK组风味较为接近。

图6 不同处理风干里脊的电子鼻结果的PCAFig. 6 PCA score plot for air-dried pork tenderloin with different treatments

2.4.2 载荷分析

由图7可知，传感器S1、S3、S5、S6、S7、S8、S9和S10对PC1贡献率最大，说明PC1主要反映烷烃、含硫化合物、芳香化合物、醇类、苯类、氮氧化合物等。传感器S4对PC1和PC2贡献率都很大，S2对PC2贡献率最大，说明PC2主要反映醇、醛、酮类。可以发现各传感器的响应都很大，因此可以通过载荷分析辅助分析PAW处理对风干肉制品风味的影响。

图7 不同处理风干里脊的电子鼻结果的载荷分析图Fig. 7 Loading analysis of air-dried pork tenderloin with different treatments

2.5 感官分析

从表6可以看出，经PAW处理的样品在风味、滋味、质地和可接受性等方面与对照组无显著差异（P＞0.05）。然而，除50 kV处理组外，PAW盐水腌制肉制品的颜色分数明显高于对照组（P＜0.05），可能是由于PAW腌制的里脊中含有足够的亚硝酸盐，可诱导肌红蛋白与NO的反应，其中NO来自亚硝酸盐的分解，在高温成熟过程中，亚硝基肌红蛋白降解为亚硝基肌色原而保持红色[29]。由于PAW处理样品中a*值的增加，使产品具有独特的腌制颜色。近年来，类似研究证明低温等离子体技术可应用于猪肉脯生产中，且最终产品无异味[5]。在与合成亚硝酸盐的比较当中，PAW腌制与亚硝酸盐腌制产品有着相似的感官特性，而且产品中残留的亚硝酸盐更低[6-7]。与添加芹菜粉作为天然亚硝酸盐来源相比，PAW处理的样品感官更好，没有异味[30]，并且可以避免芹菜可能带来的过敏问题。

表6 PAW腌制对风干里脊感官指标评分的影响Table 6 Effect of PAW curing on sensory evaluation of air-dried pork tenderloin

3 结 论

以空气为放电气体，利用DBD制备PAW腌制液，腌制后采用强化高温成熟技术生产风干里脊。结果发现，50、60、70 kV处理组样品的亚硝酸盐残留量为8.12、10.11 mg/kg和15.24 mg/kg，均低于肉制品中亚硝酸盐残留量的最大值。相比对照组，PAW处理对风干里脊生物胺有显著抑制效果，随着电压的增加，产品中各种生物胺含量均逐渐下降，其中尸胺和精胺下降显著（P＜0.05），尸胺含量分别显著（P＜0.05）下降8.21%、11.29%和19.49%，精胺含量显著（P＜0.05）下降9.64%、16.54%和27.56%，这有利于提高产品的安全性。通过电子鼻分析结果表明，PAW处理组与对照组的风味整体差异不显著，但60 kV处理组中芳香类、烷烃类、烯烃类风味化合物强度增加明显，而乙醇和含硫化合物的强度下降。对产品进行感官评价后发现，经PAW处理的样品在风味、气味、质地、可接受性等方面与对照组无显著差异。除50 kV处理组外，PAW盐水腌制产品的颜色分数显著高于对照组，说明PAW腌制能赋予产品更好的腌制色泽，是一种可行、安全的新方法。