基于紫外-可见分光光度法测定食品接触橡胶中高锰酸钾消耗量

曾少甫，郭 盼，章凯倩，胡长鹰,，刘宜奇，王志伟,*

（1.暨南大学包装工程学院，广东省普通高校产品包装与物流重点实验室，广东 珠海 519070；2.暨南大学力学与建筑工程学院，广东 广州 510632；3.暨南大学理工学院，广东 广州 510632）

橡胶是一类可逆变形的高弹性聚合物、具有良好的阻隔性、化学稳定性和抗老化特性[1-2]。与塑料相比，橡胶很少用于直接接触食品的包装，主要应用在食品加工机械设备中，如管道构件、密封圈、垫圈、垫片等[3]。同时，橡胶同时也是一种重复利用性很高的材料，更换的频率不高。由于生胶本身弹性不足，机械性能弱，需添加各种助剂以增强其性能[4]，因此，橡胶产品通常比其他塑料食品接触材料及其产品含有更多的化学成分（例如固化剂、固化促进剂、抗降解剂和增塑剂）[5-6]，这些化学成分可能会迁移到接触过的食品中，从而影响食品的安全性[7]。

高锰酸钾（KMnO4）消耗量是指食品接触材料在一定时间、温度条件下迁移到水中可被KMnO4氧化的物质总量，表明食品接触材料中可迁移出并能被氧化的水溶性物质的总和，是食品接触用材料及其制品在安全标准中的一个重要卫生指标[8-9]。KMnO4消耗量只是一个笼统的筛查指标，没有特定的指向安全风险，可用于评价材料的稳定性[10]。目前，部分国家对一些食品接触材料的KMnO4消耗量有指标要求。如日本食品卫生法No.370规定食品接触用塑料类、树脂类材料及制品的KMnO4消耗量限值[11]。韩国食品卫生法对部分食品级材质进行KMnO4消耗量测定和限制要求，但对橡胶类材质无要求[12]。美国食品药品管理局对丙烯酸树脂类制品的KMnO4可氧化浸提物的吸光度指标有限制要求。GB 4806.11—2016《食品接触用橡胶材料及制品》对食品接触用橡胶材料及制品的KMnO4消耗量的限量为10 mg/kg，是强制性检测指标[13]。

当前，氧化还原滴定法是一些国家测定KMnO4消耗量的方法（如中国、日本和韩国等）[8,11-12]。然而，官方对于实验预处理中不同橡胶材料基体中酸的量无合理的解释，不同橡胶的KMnO4消耗量适用性存在一定的差异性，对于部分含量较大的阳性样品，酸的不足会造成结果偏差，有必要进行相关探究。由于KMnO4可以氧化还原性物质并改变锰的化合价，使溶液颜色变淡，导致光吸收变弱，在某些波长下遵循朗伯定律[14-16]，因此，可以根据KMnO4消耗的吸光度确定还原物质的浓度，以紫外-可见光分光光度法进行检测。目前对于KMnO4消耗量方面的报道主要集中于产品的适用性和影响检测的因素，如Zhu Lixian等[10]分析导致食品接触用纸中KMnO4消耗量偏高的原因来源于纸浆中的淀粉及天然产物，对其适用性进行了探讨。杨建平等[17]对食品接触材料中KMnO4消耗量的影响因素研究，得出取样量、煮沸时间和加入草酸的时间是影响KMnO4消耗量测定值的重要因素。钱荣敬等[18]对食品接触用纸中KMnO4消耗量指标的适用性进行评估，发现纸张中的木质素、半纤维素、淀粉等天然成分对KMnO4消耗量的贡献率较高。本研究建立食品接触橡胶制品中KMnO4消耗量的紫外-可见光分光光度法，对实验的吸收波长、H2SO4浓度、KMnO4浓度、反应时间进行优化，并进行方法验证，为食品用橡胶制品的检测应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同类型食品接触橡胶（丁腈橡胶、三元乙丙橡胶（EPDM橡胶）、乳胶、氟碳橡胶和硅橡胶）从当地市场购得。

KMnO4、二水合草酸、H2SO4（质量分数98%）（均为分析纯） 广州化学试剂厂；MnO2粉末（CAS：1313-13-9，纯度99.9%，微米级） 台州森诺材料科技有限公司；一级水Milli-Q净水系统 德国默克公司。

1.2 仪器与设备

UV-3600i Plus紫外-可见光近红外光度计 日本岛津公司；HWS26电热恒温水浴锅、DHG-9145A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；VORTEX4IKA涡旋振荡器 德国IKA公司；S220 pH酸度计 瑞士梅特勒托莱多仪器（中国）有限公司；EMAX 7021-H型X射线能谱仪 美国Horiba公司；S-3700N扫描电子显微镜 日本Hitachi公司；K-Alpha型X射线光电子能谱 美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准储备溶液及标准曲线的配制

将KMnO4加热溶于一级水中，转移置于1 L容量瓶中，用水定容至刻度，得到浓度为0.02 mol/L的标准储备溶液，存于棕色试剂瓶中，避光保存。不同浓度标准工作溶液的制备需要同步进行“KMnO4消耗量实验”的处理。然后在波长525 nm处采用紫外-分光光度计绘制标准曲线。

1.3.2 橡胶迁移实验

参照GB 5009.156—2016《食品接触材料及制品迁移试验预处理方法通则》[19]中规定的比例（6 dm2/kg模拟液）进行，模拟物为一级水[19]。实验条件参照GB 4806.11—2016《食品接触用橡胶材料及制品》，橡胶材料于实验用容器中加入60 ℃一级水，密封保存于60 ℃恒温水浴锅中，保持0.5 h，作为实验测试用迁移液[13]。注：根据GB 5009.156—2016，以全浸泡法实验，本实验样品大于0.5 mm小于2 mm，迁移面积取正反两面面积及侧面面积之和。

1.3.3 KMnO4消耗量测试

准确移取50 mL迁移液于100 mL锥形瓶中，加入一定体积的H2SO4使用液（5 mol/L），摇动混匀，然后加入一定体积KMnO4标准储备溶液（0.02 mol/L），摇匀，加入玻璃珠并将混合物加热至沸腾并在沸腾状态下再保持6 min。待其冷却后移至50 mL玻璃刻度管，然后加入一级水定容，以弥补沸腾阶段水的蒸发。并将该溶液过0.22 µm的水相滤膜，使用紫外-可见光分光光度计测定溶液的吸光度，同时，使用一级水作为空白并按照相同的测试程序进行处理。实验流程图如图1所示。

图1 紫外-可见分光光度法测定KMnO4消耗量的实验流程图Fig. 1 Experimental flow chart for the determination of KMnO4 consumption by UV-Vis spectrophotometry

根据校准曲线，利用测量得到的空白（A1）和样品（A2）的吸光度，按式（1）计算空白和样品的浓度分别对应于C1和C2。按式（2）计算得到KMnO4消耗量的实际值。

式中：C为标准曲线定量后的样品迁移液中KMnO4的浓度/（mmol/L）；A为紫外-可见分光光度计测量的样品迁移液中KMnO4的吸光度；b为标准曲线的截距；k为标准曲线的斜率。

式中：X为试样中KMnO4消耗量/（mg/kg）；C1为空白浸泡液中KMnO4浓度/（mmol/L）；C2为样品浸泡液中KMnO4浓度/（mmol/L）；158.034为KMnO4摩尔质量（g/mol）；V1为KMnO4消耗量实验中的定容体积/L；V2为进行迁移实验得到的总模拟物浸泡液的总体积/L；V3为KMnO4消耗实验所用浸泡液的体积/L；S为迁移实验中试样与浸泡液接触的试样面积/dm2；F为在实际使用情况下，食品接触材料及制品的接触面积（S）与食品模拟物体积（V）的比（S/V），各种液态食品密度通常以kg/L计，单位dm2/kg，当实际使用情况下，S/V已知时，F即为实际S/V。

1.3.4 反应产物的提取

KMnO4消耗量实验结束后，将含有反应产物的样品溶液转移至50 mL离心管中，以6 000 r/min离心，除去液体，收集附着在管壁上的产物。由于H2SO4的存在使迁移液很难干燥，因此，将收集的产物再次用一级水稀释并离心，同样步骤处理5次，最后在温度为40 ℃的烘箱中干燥3 h，得到反应产物固体粉末，将其储存在干燥器中。

1.3.5 扫描电子显微镜-能谱仪分析

将收集到的反应产物用导电胶固定在铜台上，然后喷金箔。使用扫描电子显微镜对样品反应产物的表面进行观察，并使用配备的能谱分析仪进行局部元素分布分析。

1.3.6 X射线光电子能谱分析

为了测量元素的化学价态，使用配备单色Al Kα X射线源（hν=1 486.6 eV）的X射线光电子能谱分析收集的产物，配备180°双焦点半球分析仪，128通道检测器。

1.3.7 方法参数验证

本实验方法验证的主要内容涉及方法线性范围、检出限（limit of detection，LOD）、准确度和精密度。具体如下：按操作规程要求，配制标准工作液，验证线性范围及情况，要求至少6个浓度点，线性相关系数R2大于0.99。LOD和定量限（limit of quantitation，LOQ）根据ICH指南[20]，LOD=3.3S/b，LOQ=10S/b，其中S为6次试剂空白测定的标准偏差，b为标准曲线的斜率。以5种不同的食品接触橡胶（丁腈、三元乙丙橡胶、乳胶、氟橡胶、硅橡胶）为实验样品，每种阳性材料样品选择KMnO4消耗量分别为1、2、5 mg/kg三个水平，按照1.3.2节处理后，对迁移液分别进行紫外-可见分光光度法以及GB 31604.2—2016《食品接触材料及制品 高锰酸钾消耗量的测定》的测定，每个水平测试6个平行样作为精密度评估，以2种方法结果的方差分析比较作为准确度评估。

1.4 数据处理

采用SPSS（Version 19.0）进行进行数据处理。Duncan’s-multiple range test用于确定平均值的显著差异（P＜0.05）。Thermo Avantage v5.967软件用于对X射线光电子能谱进行数据处理。使用Origin 8.0用于图形绘制处理，结果以表示。

2 结果与分析

2.1 反应产物的扫描电子显微镜-能谱和X射线光电子能谱结果

KMnO4消耗量实验中，酸介质的选择起到重要的作用。在盐酸的情况下，盐酸与KMnO4反应，形成氯气并消耗部分KMnO4[21]，硝酸会参与氧化还原反应，干扰实验的结果。H2SO4具有挥发性低、酸性强的特点，且与稀释后的KMnO4无化学反应，比较适合作为KMnO4消耗量中反应性酸介质。在部分对橡胶制品的测试中，也发现部分迁移液在进行KMnO4消耗量实验后产生深褐色沉淀，并且随着H2SO4浓度的降低，形成更多沉淀，如图2所示，推测是H2SO4的浓度不足所导致，此时溶液的颜色由紫色变为紫红色。如果在形成固体反应产物时用分光光度计测量KMnO4消耗量的结果，会影响其结果。因此，有必要探索反应中H2SO4消耗的规律。

图2 不同H2SO4浓度下迁移液的KMnO4消耗量实验反应情况（10 mg/kg）Fig. 2 Visual observation of KMnO4 consumption for different concentrations of H2SO4 (sample concentration of 10 mg/kg)

通过扫描电子显微镜-X射线能谱仪分析，证实了反应产物粉末中某些元素的存在，如图3a、b所示，可见两者的形貌都呈絮凝形态和簇状结构，有孔隙但形状不规则，与以往对MnO2的形态研究相似[22]。利用X射线能谱仪对电镜中的区域进行分析，以确定测试样品的元素种类和含量，结果如图3c所示，根据X射线能谱仪，在反应产物粉末中发现了氧、硅和锰，其中，氧元素含量最高，为88.18%，其次是锰和硅，分别为8.76%和3.06%。硅含量的存在可能是橡胶浸泡液本身的残留附着。为了进一步分析未知反应物的化合物状态，用X射线光电子能谱测量了近表面核心能级的强度和价态，图4a展示了反应产物X射线光电子能谱全谱的主要成分是氧、锰和硅（微量）元素，其结果与X射线能谱仪吻合。图4b、c显示了未知反应产物和标物的Mn 2p1/2、Mn 2p3/2和Mn3s的光谱图，对于MnO2，在Mn2p有多峰分裂成分，并且在Mn2p3/2峰的顶部有一个可识别的形状[23]。在Mn3s峰中，MnO2有为多峰分裂组成，并且双峰结合能的差值在4.7 eV，接近MnO2标准物质的结合能差值，综合以上分析，该未知反应产物主要是MnO2。根据图2的现象，推测是由于酸浓度不足，影响了反应中Mn7+向Mn2+的转化，高浓度酸性条件有利于反应的完成，否则会向其他反应进行，对氧化还原方法的结果产生不良影响。依据X射线光电子能谱得到反应产物的信息，得出足够（式（3））和不足（式（4））的酸性条件下2个反应离子方程式：

图3 反应产物（a）、MnO2标准品（b）的扫描电子显微镜图和反应产物表面的能量色散X射线光谱仪图（c）Fig. 3 SEM images of reaction products (a) and MnO2 standard (b), and energy dispersive X-ray spectrum of surface of reaction products (c)

图4 反应产物（a）的X射线光电子能谱光谱全谱扫描图和Mn2p（b）及Mn3s（c）核心能级的X射线光电子能谱高分辨率谱扫描图Fig. 4 XPS spectra of reaction products (a), XPS high-resolution spectra of core energy levels of Mn2p (b) and Mn3s (c)

2.2 KMnO4消耗量实验吸收光谱波长的确定

图5 不同浓度KMnO4紫外-可见分光光谱（a）及一级水（含硫酸）、迁移液和实验空白紫外-可见分光光谱（b）Fig. 5 UV-Vis spectra of KMnO4 at different concentrations (a),UV-Vis spectra of ultrapure water (containing sulfuric acid), migrant solution and experimental blank (b)

KMnO4的氧化反应取决于不同的酸或碱介质。与中性和碱性条件相比，在酸性条件下氧化能力最强，此时Mn7+被还原为Mn2+，稀溶液呈无色[24-26]。利用紫外-可见光分光光度计分别对不同浓度的KMnO4标准溶液的吸光度进行扫描，结果如图5a所示，在波长200～800 nm范围内，对于不同浓度KMnO4标准溶液在波长525 nm处有最大吸收峰（λmax），并且随浓度增加吸收峰增大。图5b显示，与实验空白相比，样品迁移液在整个扫描带的吸光度较弱，对于试剂空白（含H2SO4的一级水迁移液）的吸光度，波长525 nm处的吸收峰可以忽略不计，由此来看，H2SO4的加入不影响此波段处的吸收结果，因此实验选择525 nm作为测试波长。

2.3 KMnO4消耗量实验中H2SO4浓度的优化

根据本实验结果可知，H2SO4加入量不足会导致溶液中形成固体MnO2，从而影响实验结果，为此有必要优化实验中H2SO4的浓度。H2SO4的最佳浓度可以通过水相过滤器过滤和不过滤后的吸光度是否近似评价。如图6所示，对4种不同浓度的迁移液H2SO4使用进行评价，各迁移液的吸光度随着H2SO4浓度的增加而降低，并最终趋于稳定，同时也表明增加酸浓度可以抑制反应过程中MnO2的形成。选择4种浓度迁移液（通过GB 31604.2—2016定量）的H2SO4最低需求浓度，进行线性拟合分析，求出H2SO4最低需求浓度与迁移液消耗量浓度的关系。结果表明本方法1 mg/kg的KMnO4消耗量至少需要0.1 mol/L的H2SO4。

图6 KMnO4消耗量反应中H2SO4浓度的优化结果Fig. 6 Optimization of the concentration of H2SO4 in the reaction of KMnO4 consumption

2.4 KMnO4消耗量实验中KMnO4浓度的优化

图7 KMnO4消耗量反应中KMnO4浓度的优化结果Fig. 7 Optimization of the concentration of KMnO4 in the reaction of KMnO4 consumption

由于实验中KMnO4可能被高浓度的迁移液所还原，导致缺少KMnO4与之反应，此时迁移液显无色，进而难以准确对所消耗的KMnO4进行定量，所以需要对KMnO4的添加浓度进行合理的估算。如图7所示，吸光度随着浓度上升而增大，当吸光度接近“0”时，此时KMnO4浓度与迁移液中还原性有机物的浓度临近，取此时KMnO4浓度与迁移液浓度进行线性拟合，可以得到KMnO4浓度与迁移液消耗量浓度之间的关系，从分析结果可知对实验中KMnO4消耗量为1 mg/kg的迁移液，KMnO4的需求浓度应超过0.005 74 mmol/L。

2.5 KMnO4消耗量实验中反应时间的优化

图8 KMnO4消耗量反应中反应时间的优化结果Fig. 8 Optimization of reaction time for KMnO4 consumption

KMnO4与还原性有机物反应需要一定的时间，确保反应完全，同时也应该控制在适当时间范围内，避免长时间下有机物与KMnO4的二次反应，影响实验结果。依照1.3.3节步骤，研究10 mg/kg在不同反应时间点（0～6 min）对KMnO4消耗后的吸光度情况。如图8所示，不同浓度迁移液的KMnO4消耗量吸光度随反应时间呈快速下降趋势，直至4～6 min时无显著性差异。根据相关文献，有机物质与KMnO4的反应时间一般在5～10 min内[17,27-29]。实验中也发现，反应首先出现褪色现象溶液呈现淡紫色，但如继续延长反应时间，颜色可能发生其他改变，推测其为有机物的二次氧化反应所导致，因此时间不宜过长，综合考虑反应完成的最佳时间终点取6 min。

2.6 方法验证

2.6.1 方法的线性范围及LOD结果

表1 高锰酸钾标准溶液的线性方程、相关系数、线性范围、方法LOD和方法LOQTable 1 Linear equation, correlation coefficient, linear range, detection limit and quantification limit of the proposed method

按照1.3.1节储备液配制方法，以一级水作为溶剂配制标准溶液，形成系列水平的标准液，以吸光度（A）为纵坐标，浓度值（C）为横坐标，绘制标准曲线，采用最小二乘回归法计算校准方程和相关系数，结果如表1所示，KMnO4标准曲线在0.014～0.280 mmol/L范围内线性关系良好，相关系数R2为0.998 91。该方法的LOD和LOQ分别为6.8×10-4mol/L和2.0×10-3mol/L。

2.6.2 准确度和精密度结果

如表2所示，紫外-可见光分光光度法检测的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在1.7%～7.8%之间，其精密度较好，重复性良好，高浓度样品的RSD低于低浓度样品（P＜0.05）。利用独立样本t检验对方法准确性进行评价，发现t值和F值均未超过95%置信水平下的值，表明这2种方法无显著性差异。结果表明紫外-可见分光光度法具有良好的准确度和精密度，适用于食品接触橡胶制品KMnO4消耗量的分析。

表2 本方法和GB 31604.2—2016方法的精密度和统计比较（n=6）Table 2 Precision and statistical comparison between UV-Vis spectrophotometric method and official redox titration method (n = 6)

3 结 论

本研究证实KMnO4消耗量实验过程中H2SO4浓度的不足会形成MnO2的现象，因此，反应需要在高浓度酸性环境中进行。建立一种测定食品接触用橡胶中KMnO4消耗量的紫外-可见分光光度法。对方法中H2SO4浓度、KMnO4浓度、反应时间进行优化，对于1 mg/kg的阳性橡胶样品，H2SO4溶液浓度需高于0.1 mol/L，KMnO4溶液浓度需超过0.005 74 mmol/L，反应最佳时间为6 min。方法中标准曲线相关系数R2为0.998 91，线性关系良好，LOD和LOQ分别为6.8×10-4mol/L和2.0×10-3mol/L，符合的分析要求。5种食品接触性橡胶阳性样品检测的KMnO4消耗量值的RSD在1.7%～7.8%之间，精密度良好，以独立样本t检验对比GB 31604.2—2016所测的结果，2种方法无显著性差异，因此，本方法可靠、准确，可作为食品接触橡胶制品中KMnO4消耗量的定量检测手段。