高直链玉米III型抗性淀粉制备及其结构和特性

曾凯骁，王鹏杰，任发政,，张树成，张嘉茜，刘思源,*，文鹏程,*

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.中国农业大学营养与健康系，北京 100083；3.烟台双塔食品股份有限公司，山东 烟台 265400）

1982年英国生理学家Englyst等[1]发现了一类不能被淀粉酶水解的淀粉，并将这种具有酶抗性的淀粉称之为抗性淀粉[2]。目前，抗性淀粉可分为5 类[3]：I型（物理包埋淀粉），主要存在于部分研磨的谷物和种子中；II型（抗性淀粉颗粒），主要存在于天然高直链玉米、绿香蕉和生马铃薯等淀粉中；III型（回生淀粉），指淀粉经过糊化、老化过程而产生的抗消化淀粉；IV型（化学改性淀粉），指通过酯化、醚化作用形成的交联淀粉；V型（直链淀粉-脂类复合物），指淀粉与脂肪酸或脂肪醇等形成的复合物。其中III型抗性淀粉具有热稳定性高、持水性低、无异味、口感细腻等特性[4]，在食品研究、开发与生产应用中潜力巨大。

近些年，虽然有关III型抗性淀粉的制备研究较多，但以高直链玉米淀粉为原料研制III型抗性淀粉，并研究其结构和消化特性却鲜有报道。相较于普通谷物类、薯类和豆类淀粉，高直链玉米淀粉具有直链淀粉含量高、淀粉分子链线性好、分子质量小、淀粉链排列紧密等特性，有研制高得率III型抗性淀粉的优势。III型抗性淀粉也因其具备绿色标签、抗性淀粉含量高、具有饱腹感、消化率低、血糖生成指数低等特点，受到人们的广泛关注[5]。

本研究以高直链玉米淀粉G50（直链淀粉占比约50%）和G70（直链淀粉占比约70%）为原料研制高抗消化性的III型抗性淀粉；采用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）对抗性淀粉的结构特征进行分析，并采用差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）、快速黏度分析仪（rapid viscosity analyser，RVA）、体外模拟抗性淀粉在人体的消化等方法对抗性淀粉的功能特征进行分析，以探究抗性淀粉结构和功能特征与其抗消化特性之间的关系，有助于进一步了解抗消化性机制，为国产III型抗性淀粉的商业化生产和应用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Gelose 50高直链玉米淀粉（G50）、Gelose 70高直链玉米淀粉（G70） 荃银祥玉（北京）生物科技有限公司；普鲁兰酶（浓度1 000 NPUN/g）、α-淀粉酶（比活力30 U/mg）、淀粉葡萄糖苷酶（浓度260 U/mL）西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；D-葡萄糖检测试剂盒（GOPOD法） 爱尔兰Megazyme公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JSM-7610F型SEM 日本电子株式会社；D8 Advance型XRD仪 德国Bruker公司；214 Polyma DSC仪美国TA Instruments公司；4800型RVA 澳大利亚Perten公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；KA-1000台式离心机 上海安亭科学仪器厂；ME2002电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高直链玉米III型抗性淀粉的制备

参考Li Liying等[6]方法并稍作修改，以G50和G70为原料，采用酸解、糊化、脱支和重结晶制备高直链玉米III型抗性淀粉，记为G50-RS3和G70-RS3。

1.3.1.1 酸解

精确称取一定质量的G50或G70（干基）于锥形瓶中，加入0.8 mol/L HCl溶液配制成质量分数30%的淀粉乳，置于50 ℃恒温摇床中振荡水解20 h。用4.0 mol/L NaOH溶液将酸解后的淀粉乳中和至中性，再用无水乙醇和蒸馏水分别清洗3次，置于45 ℃烘箱中隔夜烘干，得到酸解淀粉。按下式计算酸解后得率：

1.3.1.2 糊化

精确称取一定质量的G50或G70酸解淀粉于烧杯中，加入适量0.01 mol/L pH 4.0乙酸钠缓冲液配制成质量分数为6.25%的淀粉乳，置于130 ℃恒温油浴锅中剧烈搅拌2 h（预糊化），转移至121 ℃高压灭菌锅中糊化1 h，得到糊化淀粉。

1.3.1.3 脱支

将G50或G70糊化淀粉乳冷却至50 ℃，然后按照酸解淀粉（干基）的质量计算，每克淀粉添加0.13 mL普鲁兰酶，置于50 ℃恒温摇床中脱支反应24 h，转移至121 ℃高压灭菌锅中灭酶杀菌30 min，得到脱支淀粉。

1.3.1.4 重结晶

将G50或G70脱支淀粉乳置于30 ℃恒温培养箱中老化24 h，用蒸馏水清洗后置于45 ℃烘箱中隔夜干燥，粉碎通过125 µm筛得到G50-RS3和G70-RS3。按下式计算重结晶后得率：

1.3.2 高直链玉米III型抗性淀粉的退火处理

采用Jacobasch等[7]的方法并进行少量修改。精确称取一定质量的G50-RS3或G70-RS3于锥形瓶中，分别使用蒸馏水配制成含水率为40%、50%、60%、70%（淀粉质量按干基计）的淀粉乳样品。将不同含水率的样品分别混合均匀，密封后水合12 h，置于烘箱中90 ℃加热24 h。加热结束后在室温下冷却3 h停止退火，将样品于45 ℃隔夜烘干得到退火处理的抗性淀粉样品，记为G50-RS3-退火40%、G50-RS3-退火50%、G50-RS3-退火60%、G50-RS3-退火70%、G70-RS3-退火40%、G70-RS3-退火50%、G70-RS3-退火60%、G70-RS3-退火70%。

1.3.3 高直链玉米III型抗性淀粉的压热处理

采用Jacobasch等[7]的方法并进行少量修改。精确称量一定质量的G50-RS3或G70-RS3于锥形瓶中，分别使用蒸馏水配制成含水率为10%、20%、30%、40%（淀粉质量按干基计）的淀粉乳样品。将不同含水率的样品分别混合均匀，密封后水合12 h，置于121 ℃高压灭菌锅中压热1 h。压热结束后在室温下冷却2 h停止压热，将样品于45 ℃隔夜烘干得到压热处理的抗性淀粉样品，记为G50-RS3-压热10%、G50-RS3-压热20%、G50-RS3-压热30%、G50-RS3-压热40%、G70-RS3-压热10%、G70-RS3-压热20%、G70-RS3-压热30%、G70-RS3-压热40%。

1.3.4 高直链玉米III型抗性淀粉的形貌测定[8]

将抗性淀粉样品均匀涂抹在样品台上，进行喷金处理，通过SEM观察淀粉颗粒形貌。扫描条件：电压100 kV；加速电压20 kV；放大100、300、1 000 倍。

1.3.5 高直链玉米III型抗性淀粉的结晶结构测定[9]

取抗性淀粉样品在25 ℃和100%相对湿度下平衡24 h，进行XRD检测。衍射条件：特征射线CuKα；电压40 kV；电流44 mA；扫描范围1°～45°；扫描速率2°/min。使用MDI Jade 6软件计算淀粉的相对结晶度。

1.3.6 高直链玉米III型抗性淀粉的溶解度与膨胀度测定

在15 mL离心管中加入0.1 g抗性淀粉样品，用蒸馏水配制成质量分数为1%的淀粉乳，于80 ℃加热30 min，每5 min振荡1次。待其冷却至室温后，置于离心机中4 500 r/min离心15 min，称量沉淀质量（m1）。将上清液置于105 ℃烘箱中烘至质量恒定，称量被溶解的抗性淀粉质量（m2）。按式（3）、（4）计算抗性淀粉的溶解度和膨胀度[10]。

式（3）、（4）中：m为淀粉干基质量。

1.3.7 高直链玉米III型抗性淀粉的热性能测定[11]

采用DSC仪进行测定，准确称取10 mg淀粉样品到不锈钢盘中，然后使用微量注射器加入3 倍质量的蒸馏水彻底水合。将盘密封后，样品在室温下平衡2 h以上，然后以10 ℃/min速率从10 ℃扫描到140 ℃。使用Pyris 13.3.1.0014软件分析DSC谱图中吸热峰的起始糊化温度（To）、峰值糊化温度（Tp）和终止糊化温度（Tc）。每个样品测试3次[11]。

1.3.8 高直链玉米III型抗性淀粉的糊化特性测定

采用RVA标准程序，通过TCW3软件得到抗性淀粉糊化温度、峰值时间、峰值黏度、最终黏度、低谷黏度、崩解值和回生值等糊化参数[12]。

1.3.9 高直链玉米III型抗性淀粉的体外消化特性测定

采用Englyst等[13]的方法并进行少量修改。实验使用的高直链玉米淀粉G50和G70的总淀粉含量均为97.5%。具体方法如下：精确称量600 mg抗性淀粉样品（干基）于50 mL离心管中，加入15 mL蒸馏水在沸水浴中搅拌蒸煮10 min。蒸煮结束后向淀粉样品中加入5 mL乙酸缓冲液、50 mg瓜尔胶，并在37 ℃水浴中平衡样品10～15 min。然后加入5 mL新制备的α-淀粉酶（30 U/mg）和淀粉葡萄糖苷酶（260 U/mL）的混合酶，充分涡旋，于37 ℃水浴中水解淀粉。水解至第20、120分钟时，分别取出250 μL样品（记为G20、G120样品），将其转移至含有10 mL 66%乙醇溶液的离心管中充分涡旋，3 000×g离心10 min。取100 μL上清液，用MegazymeD-葡萄糖检测试剂盒测定酶解20、120 min后释放的葡萄糖量。并按下式计算抗性淀粉样品的快速消化淀粉（20 min内消化）、慢消化淀粉（消化20～120 min）和抗性淀粉（120 min内不消化）含量：

式（5）～（7）中：AG20、AG120和Astd分别为G20、G120样品和葡萄糖标准液的吸光度；m1为淀粉湿基质量/g；m0为淀粉干基质量/g；10为乙醇体积/mL；0.25为加入离心管的样品体积/mL；25为淀粉消化液总体积/mL；0.9为葡萄糖含量转换为淀粉含量的换算系数；97.5为高直链玉米淀粉的总淀粉含量/%。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 酸解、重结晶对高直链玉米III型抗性淀粉得率的影响

淀粉是由直链淀粉和支链淀粉组成，其片层结构是由有序的结晶区域和无序的无定形区域构成[14]。无定形区中淀粉分子链排列疏松容易被酸和酶水解，分子平均聚合度降低，其中聚合度小于10的短分子链容易被洗脱[15]。由表1可知，G70酸解后和重结晶后的得率均大于G50，原因是G70中直链淀粉含量大于G50，而支链淀粉对酸解和酶解的抵抗性弱，导致G50更容易被酸和酶水解，该结果与闫溢哲等[16]研究结果一致。

表1 G50和G70高直链玉米淀粉酸解后和重结晶后的得率Table 1 Yields of type III resistant starch from high-amylose maize starch G50 and G70 after acid hydrolysis and recrystallization

2.2 高直链玉米III型抗性淀粉的形貌分析

结合抗性淀粉样品消化特性的结果，选择退火和压热处理时抗性淀粉含量最高的G50-RS3-退火60%、G70-RS3-退火60%、G50-RS3-压热20%、G70-RS3-压热20%样品做形貌分析，探究淀粉颗粒的形貌与高抗消化性之间的关系。

由图1a和b可知，两种高直链玉米淀粉表面光滑，都出现长条状复合颗粒结构，其中G70颗粒尺寸更小，大小相对均一。由图1c和d可知，G50-RS3和G70-RS3与G50和G70相比发生了明显的变化，两种III型抗性淀粉均形成了大小不等、颗粒形貌不规则的聚集体。还可明显地看出G50-RS3原有的淀粉颗粒形貌已被完全破坏，而G70-RS3还存在颗粒状形貌（黄色箭头），这可能是因为G70比G50直链淀粉含量高，分子排列更紧密，所以G70耐高温、抗酸解和抗脱支能力更强。此外，G50-RS3和G70-RS3经过退火和压热后形成了由更为细小的颗粒组成的聚集体，这可能是由于退火和压热处理细化了重结晶淀粉的晶粒，完美了结晶结构，消除了结构缺陷，所以使高直链玉米III型抗性淀粉的抗酶解性更强。

图1 放大1 000 倍下G50、G70高直链玉米淀粉及其III型抗性淀粉的SEM图Fig. 1 SEM images of high-amylose maize starch and type III resistant starch

2.3 高直链玉米III型抗性淀粉的结晶结构分析

由图2可知，原G50和G70的XRD曲线在5.5°、15.0°、17.3°和20.0°附近呈现4个强衍射峰，这是典型的B+V型结晶结构，其中20.0°处的衍射峰说明，高直链玉米淀粉中直链淀粉与淀粉本身的脂质形成了直链淀粉-脂质复合物，显示出V型的结晶结构[17-18]；改性后淀粉样品的XRD曲线在17.3°、20.0°、22.5°和24.0°附近呈现4个强衍射峰，并伴随5.5°处衍射峰的消失，这表明经过改性处理高直链淀粉的结晶类型由B+V型向A+V型转变[19]。原因是G50和G70淀粉经酸解和酶解脱支以后，淀粉结晶结构重新排列，晶胞中的水分减少，因此变为结晶结构更为紧密的A+V型，而退火和压热处理修复了G50-RS3和G70-RS3的残缺结晶结构，使结晶结构更加稳定，所以退火和压热处理后淀粉样品的结晶型保持A+V型。

依据结晶峰面积占总面积的百分比可计算淀粉样品的结晶度[20]。如图2所示，G50-RS3和G70-RS3相比于G50和G70衍射峰强度增大，结晶度明显提升，这主要是淀粉酶解脱支后形成了大量短直链，这些短直链通过氢键相连，重新定向排列形成了大量双螺旋微晶所致。经退火和压热处理后，除G70-RS3-压热10%淀粉样品的结晶度略低于G70-RS3以外，所有淀粉样品的结晶度均进一步提升，其中以含水率60%的退火和含水率20%的压热处理的淀粉样品最为明显，说明该处理可以有效增强淀粉微晶的有序性，优化其稳定性[19,21-22]。Martens等[23]报道淀粉较高的结晶度与其较低的消化率有关，说明淀粉结晶度高，晶体结构更为致密、稳定性较好、抗酶解性能更强。

图2 G50（A）、G70（B）高直链玉米淀粉及其III型抗性淀粉的XRD图谱Fig. 2 XRD patterns of high-amylose maize starch G50 and type III resistant starch (A), and G70 and type III resistant starch (B)

2.4 高直链玉米III型抗性淀粉的溶解与膨胀特性分析

由图3可知，G50在改性前后，其溶解度均高于G70，该结果证明直链淀粉具有抑制淀粉颗粒糊化和吸水膨胀的作用。原G50和G70经过酸解、糊化、脱支和重结晶后溶解度显著升高（P＜0.05），这主要与原淀粉的脱支酶解有关，脱支酶解使原高直链玉米淀粉的短直链含量增加，支链淀粉被部分酶解，溶解度增加。Koo等[24]对类似的结果进行了解释：普鲁兰酶的脱支作用降低了酶解淀粉的分子质量，提高了其溶解性。经退火和压热处理后，除G50-RS3-压热10%样品外，其他淀粉样品的溶解度均显著下降（P＜0.05），这是因为G50-RS3和G70-RS3在退火和压热处理后，淀粉中不完整的双螺旋组成的微晶结构被修复，游离的淀粉分子链紧密排列，形成了更多微晶结构，因此有效抑制了淀粉链的析出。

图3 G50、G70高直链玉米淀粉及其III型抗性淀粉的溶解度Fig. 3 Solubility of high-amylose maize starch and type III resistant starch

淀粉颗粒的膨胀度可以反映淀粉颗粒内氢键度，淀粉膨胀度越低，表明淀粉分子链之间氢键结合更为紧密[25-26]。如图4所示，由于直链淀粉含量较高，原G70膨胀度低于原G50。酸解、糊化、脱支和重结晶后G50的膨胀度没有发生显著变化；退火和压热处理后，淀粉样品的结晶度进一步提高，使G50-RS3在退火和压热后膨胀度显著降低（P＜0.05）。原G70淀粉颗粒结构紧密，改性后G70的膨胀度均高于原G70。

图4 G50、G70高直链玉米淀粉及其III型抗性淀粉的膨胀度Fig. 4 Swelling power of high-amylose maize starch and type III resistant starch

2.5 高直链玉米III型抗性

采用DSC分析淀粉样品的热性质时，由于淀粉颗粒中的无定形区与结晶区连结，随着温度的升高，淀粉颗粒在过量水中受热吸水膨胀，无定形区先被破坏，结晶区在持续的高热条件下也开始熔融，说明结晶区的耐热性要高于无定形区[27-28]。因此，结合对淀粉结晶结构和消化特性结果的分析，选择经退火和压热处理后结晶度和抗性淀粉含量最高的G50-RS3-退火60%、G70-RS3-退火60%、G50-RS3-压热20%、G70-RS3-压热20%的淀粉样品进行热性质分析，探究淀粉的糊化温度和结晶度与消化特征的关系。

由表2可知，G50和G70经过酸解、糊化、脱支和重结晶后，To、Tp和Tc均较原淀粉显著提高（P＜0.05），退火与压热处理使得淀粉糊化温度进一步升高。结合图2发现，淀粉结晶度与糊化温度的变化趋势一致，可能是由于结晶度增加，淀粉的内部结构更加紧密坚固，热稳定性越高，糊化越困难。

表2 G50、G70高直链玉米淀粉及其III型抗性淀粉的热特性参数Table 2 Thermal properties of high-amylose maize starch and type III resistant starch

2.6 高直链玉米III型抗性淀粉的糊化特性分析

淀粉的糊化特性与其结构特征相关，而稳定且结晶度高的淀粉结构能保证淀粉不被快速消化。因此，结合对淀粉结晶结构和消化特性结果的分析，选择经退火和压热处理后结晶度和抗性淀粉含量最高的G50-RS3-退火60%、G70-RS3-退火60%、G50-RS3-压热20%、G70-RS3-压热20%的淀粉样品进行糊化特性分析，探究淀粉的糊化黏度和结晶度与消化特征的关系。

由图5可知，原G50的峰值黏度远大于原G70，表明直链淀粉有效抑制了淀粉颗粒的膨胀；冷却过程中直链淀粉分子间的相互作用强于支链淀粉，导致原G70的最终黏度高于原G50。改性后的淀粉样品黏度基本为零，且温度的升高对其黏度几乎没有影响，这是由于淀粉颗粒在热加工中无法吸水膨胀贡献黏度，表明样品热稳定性良好，退火和压热处理没有破坏G50-RS3和G70-RS3淀粉颗粒的热稳定结构。这与Lee等[29]使用普鲁兰酶处理大米淀粉后黏度的变化结果一致。原G50和G70淀粉因酸解和酶解脱支后，形成的大量由直链淀粉通过氢键相连的双螺旋微晶结构，增加了颗粒内淀粉链之间的内部结合力，抑制了淀粉颗粒的溶胀和直链淀粉的析出，使淀粉颗粒很难发生溶胀，黏度无法增加。此外，退火和压热处理优化了G50-RS3和G70-RS3结晶结构，消除了结构缺陷，使高直链玉米III型抗性淀粉的热稳定性更强。

图5 G50（A）、G70（B）高直链玉米淀粉及其III型抗性淀粉的RVA曲线Fig. 5 RVA curves of high-amylose maize starch G50 and type III resistant starch (A), and G70 and type III resistant starch (B)

2.7 高直链玉米III型抗性淀粉的体外消化特性分析

如表3、4所示，原G70的抗性淀粉含量显著大于原G50（P＜0.05），这可能与G70较高的直链淀粉含量有关，直链淀粉限制了淀粉颗粒膨胀，降低了G70在应用蒸煮条件下的溶解度，进而降低了淀粉消化性。原G50和G70的快速消化淀粉含量经酸解、糊化、脱支和老化制备成G50-RS3和G70-RS3后显著下降，抗性淀粉含量显著提高（P＜0.05），这主要是因为脱支处理产生了更多的短直链淀粉，这些短直链淀粉之间通过氢键相连，定向排列形成许多双螺旋微晶，这种微晶结构使得酶与淀粉的接触位点减少，增强抗酶解性。Zhang Huanxin等[30]研究了普鲁兰酶对玉米抗性淀粉含量的影响，得出了相似的结果。此外，不同含水率下退火和压热处理均能进一步降低G50-RS3和G70-RS3的快速消化淀粉含量并提高抗性淀粉含量，其中含水率60%下的退火处理和含水率20%下的压热处理对抗性淀粉含量的提高最显著：例如，含水率20%下的压热处理后，G50-RS3的快速消化淀粉含量从35.0%降至13.5%，抗性淀粉含量从53.6%提高至79.4%；G70-RS3的快速消化淀粉含量从33.4%降至13.0%，抗性淀粉含量从63.6%提高至80.5%。

Jayakody等[31]研究了退火对小麦抗性淀粉性质的影响，发现退火处理时水分子参与淀粉链氢键的结合，增强淀粉的塑化效果，半结晶结构中不定形薄层区域内的葡聚糖链的流动性增加，使淀粉颗粒中已经部分解开的双螺旋结构重新排列成微晶结构，导致颗粒中更多微晶结构的形成[32]。因此可以推断，退火和压热处理优化了G50-RS3和G70-RS3中的微晶结构，使得淀粉无定形区的刚性增强，热稳定性升高，水解耐受性增强，因而抗消化能力更强。结合改性前后所有高直链玉米III型抗性淀粉的抗性淀粉含量与结晶度和糊化温度的相关性分析表明（表5），高直链玉米III型抗性淀粉中抗性淀粉含量与淀粉的结晶度和糊化温度呈显著正相关，说明淀粉样品的高抗消化性与淀粉的结晶结构和功能特性存在必然联系。

表3 退火处理的淀粉样品消化结果Table 3 Digestibility of annealed starch samples %

表4 压热处理的淀粉样品消化结果Table 4 Digestibility of autoclaved starch samples%

表5 高直链玉米III型抗性淀粉的抗性淀粉含量与结晶度和糊化温度的Pearson相关性Table 5 Pearson correlation coefficients of resistant starch content with crystallinity and pasting temperature of high-amylose maize type III resistant starch

3 结 论

以高直链玉米淀粉为原料通过酸解、糊化、脱支和重结晶步骤获得III型抗性淀粉。退火与压热处理可进一步提升淀粉的抗性比例，其中在含水率20%下压热处理，抗性淀粉含量最高，可达80.5%。酸解协同脱支酶酶解改性可改变淀粉形貌，使得淀粉结晶类型由B+V型转变为A+V型，所得III型抗性淀粉热稳定性良好，加热过程中几乎不产生黏度；后续退火与压热处理优化了淀粉的结晶结构、提高了结晶度、降低了其溶解性与膨胀度。Pearson相关性分析表明，III型抗性淀粉中抗性淀粉含量与结晶度、糊化温度呈显著正相关。具有高耐热性的III型抗性淀粉可作为新型原料应用于部分功能食品。