龟龄酒薄层色谱条件的优选*

张 拓，曹 斌，陈加诺,陈 姗，宋 琳，冯锁民**，李惠民，杨 祎，崔 喆，梁 超，沈丹彤，高科论

(1.西安医学院 药学院，陕西 西安 710021；2.陕西医药控股集团山海丹药业股份有限公司，陕西 西安 710075；3.中国人民解放军空军军医大学，陕西 西安 710032；4.商洛职业技术学院，陕西 商州 726000；5.陕西学前师范学院，陕西 西安 710061)

龟龄酒为医院制剂，该方由人参、淫羊藿、鹿茸、海马等19味名贵中药组成，具有补肾壮阳、健脾和胃、养血益精、增进食欲、延缓衰老、抗疲劳的功效，用于治疗肾阳虚衰、气血不足等症[1-2]。龟龄酒以龟龄命名，取其长寿之意，乾隆皇帝盛赞“龟龄集乃补酒至尊”。由于该品种原质量标准没有薄层定性检测项目，按照陕西省药监局药品注册处的要求，必须限期对该医院制剂的质量标准进行提升，为此，重点对处方中的君药人参和淫羊藿等，进行了薄层色谱鉴别方法的研究，为该产品质量标准提高提供理论和实验依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、环己烷、乙醚、氨水：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；薄层硅胶G：化学纯，青岛海洋化工有限公司；羧甲基纤维素钠：化学纯，上海山浦化工有限公司；水：高纯水。人参皂苷Rg：批号0703-200119；人参皂苷Re：批号110754-200822；淫羊藿苷：批号110737-200415；以上对照品均购于中国药品生物制品检定所。龟龄酒：260 mL/瓶,批准文号陕药管制字(2001)第2900号，西安航天总医院制剂室生产。

电子天平：ALC-210.4,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；旋转蒸发仪：RE-2000A，巩义市予华仪器有限责任公司；电热恒温水浴锅：DZKW-D-2，北京市永光明医疗仪器厂；超声波清洗器：KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司；三用紫外分析仪：ZF-7型，上海嘉鹏科技有限公司；循环水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)，巩义市予华仪器有限责任公司；电热鼓风干燥箱：DHG-9140B，上海安亭科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 龟龄酒中人参的薄层鉴别

1.2.1.1 人参皂苷Re对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg人参皂苷Re的对照品溶液。

1.2.1.2 人参皂苷Rg1对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷Rg1约2 mg，加甲醇1 mL使溶解。

1.2.1.3 供试品溶液的制备[3-5]

取50 mL龟龄酒，水浴蒸至无酒精味，用处理过的D-101型大孔树脂浸泡吸附并装柱，分别用纯化水、30%乙醇洗脱至无颜色，弃去洗脱液。再用70%乙醇洗至无颜色，收集洗脱液，蒸干，残渣用10 mL水饱和的正丁醇溶解，用氨试液洗3次(10 mL×3)，摇匀，放置分层，取上层液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

1.2.1.4 人参对照药材溶液的制备

取人参对照药材1 g，加三氯甲烷40 mL，加热回流1 h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水0.5 mL搅拌湿润，加水饱和正丁醇10 mL，超声处理30 min，滤过，滤液加氨试液洗3次(20 mL、15 mL、10 mL)，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为人参对照药材溶液。

1.2.1.5 阴性供试品溶液的制备

按龟龄酒制备方法，去掉处方中人参药材，制备缺人参的龟龄酒，按1.2.1.3方法制备缺人参的阴性供试品溶液。

1.2.1.6 薄层方法

照《中国药典》2020版四部0502薄层色谱法试验[6]，吸取上述5种溶液各1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(体积比15∶40∶22∶10)低于10 ℃放置的下层溶液为展开剂，饱和15 min，上行展开8 cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外灯365 nm下检视。

1.2.2 龟龄酒中淫羊藿的薄层鉴别

1.2.2.1 对照品溶液的制备

称取淫羊藿苷加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液[7]。

1.2.2.2 供试品溶液的制备

取龟龄酒50 mL，水浴蒸干，残渣加乙醇30 mL超声处理30 min，过滤，滤液蒸干，加纯化水10 mL溶解，用乙酸乙酯萃取2次(15 mL×2)，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

1.2.2.3 阴性供试品溶液的制备

按龟龄酒处方，去掉淫羊藿制成药酒，按1.2.2.2方法制成不含淫羊藿药材的阴性样品溶液。

1.2.2.4 薄层方法

按《中国药典》2020版四部0502薄层色谱法试验[6]，吸取上述3种溶液各1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)低于10 ℃放置12 h的下层溶液为展开剂，饱和15 min，上行展开8 cm，取出，晾干，喷以5%的三氯化铝乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯365 nm下检视。

2 结果与讨论

2.1 结果

2.1.1 龟龄酒中人参的薄层结果

龟龄酒中人参的薄层结果见图1。

日光下

由图1可知，供试品色谱中在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上分别显相同颜色的斑点或荧光斑点，阴性供试品在对应位置无斑点，表明该色谱条件分离良好，阴性供试品无干扰，龟龄酒中含有人参药材。

2.1.2 龟龄酒中淫羊藿的薄层结果

龟龄酒中淫羊藿的薄层色谱结果见图2。

(紫外线365 nm照射下)图2 龟龄酒中淫羊藿药材的薄层色谱图

由图2可知，供试品色谱中，在与淫羊藿苷对照品色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照在相应位置无荧光斑点出现。表明该色谱条件分离良好，阴性供试品无干扰，龟龄酒中含有淫羊藿苷。

2.2 讨论

2.2.1 龟龄酒中人参供试品溶液制备方法筛选

为了获得理想的薄层分离效果，对龟龄酒中人参供试品溶液处理方法进行了4种筛选，见表1。从表1薄层结果及原因分析可以看出，在中国药典[8]单味人参药材供试品处理方法(1)基础上，进行改良，通过D-101型大孔树脂富集除去水溶性及极性较大成分，筛选出的方法(4)，即正文1.2.1.3方法为最佳方法，薄层效果最为理想。

表1 龟龄酒中人参供试品溶液处理方法的筛选

2.2.2 龟龄酒中淫羊藿供试品溶液制备方法的筛选

为了得到合适的样品处理方法，对龟龄酒中淫羊藿样品的处理方法分别按表2进行了2种方法的比较，方法(2)即正文1.2.2.2之法，由于在方法[8](1)基础上增加了用水溶解，乙酸乙酯萃取步骤，除去了样品中水溶性极性大成分和极性小成分的干扰[9-10]，所得薄层色谱斑点圆整，较集中，因此1.2.2.2为龟龄酒中淫羊藿供试品处理的最佳方法。

表2 龟龄酒中淫羊藿供试品溶液制备方法筛选

2.2.3 龟龄酒中淫羊藿样品薄层展开溶剂系统筛选

对龟龄酒中淫羊藿样品的薄层展开溶剂系统分别按表3进行了3种筛选，(1)展开溶剂系统薄层结果严重拖尾，斑点不清晰，不合适。(2)和(3)展开系统的薄层色谱分别见图3和图2，从图3可以看出，采用(2)展开溶剂系统，斑点清晰可见，但对照品斑点拖尾，且RF值太小。以(3)三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)(10 ℃放置12 h后取下层)作为展开剂展开后，供试品在对照品相应位置上斑点集中，拖尾较少，因此最终选用三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)下层作为龟龄酒中淫羊藿薄层展开溶剂系统,薄层结果见图3。

表3 龟龄酒中淫羊藿样品薄层展开剂筛选

龟龄酒中淫羊藿以环己烷-正丁醇-水(体积比1∶1∶2)为展开剂的TLC结果见图3。

紫外光365 nm图3 龟龄酒中淫羊藿以(2)环己烷-正丁醇-水(1∶1∶2)为展开剂的TLC色谱图

3 结 论

龟龄酒为医院制剂，在西安航天总医院已使用多年，为了使该品种的质量标准能够符合医院制剂注册的新要求，本实验所确定的处方中君药人参、淫羊藿等药材薄层色谱鉴别方法，专属性强，重现性良好，可用于龟龄酒主要药材的定性质量控制，同时也为质量标椎准提高提供科学依据。