低温等离子体活化介质诱导真皮间充质干细胞凋亡研究

王媛，毛莹莹，向虹怡，冯耀元，张惠娜，刘宣辰，袁威，贺鑫梅，邢晓娅，韩英浩

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

低温等离子体（Non-thermal Atmospheric Pressure Plasma，NTAPP），作为一种由电子和离子群组成的近电中性电离气体，因其温度接近室温，且在大气压下即可产生，也被称作大气压低温等离子体，其组分主要包括活性粒子、紫外辐射、带电粒子及瞬时电场[1]。近年来，因其很容易在空气中生成，使用时不会对细胞造成热损伤而被广泛应用于血液凝固、伤口愈合、消毒灭菌、牙齿美白和溃疡治疗上[2-3]，可见，NTAPP的临床应用已成为一个非常活跃的研究领域。

先前关于NTAPP在人类细胞的临床应用的研究主要集中在其诱导坏死[4]或凋亡[5-7]的能力。一些研究小组已经证明，NTAPPs可诱导肿瘤细胞凋亡[8-9]，并减少小鼠异种移植模型的肿瘤体积[10]，从而提示NTAPP在癌症治疗中的应用。越来越多的证据表明，在低温等离子体与细胞作用过程中，培养基内的ROS等物质浓度显著增加，从而诱发细胞凋亡[11]，可见，活性氧（ROS）是体外NTAPP诱导的细胞凋亡的主要参与者。然而，最近的研究表明，NTAPP也可以促进胚胎成纤维细胞（IMR90）和脂肪间充质干细胞（AMSCs）的增殖[12]，此外也有研究人员发现NTAPPs通过激活人角质形成细胞HaCa T细胞系的NRF2信号通路，在体外加速伤口愈合[13]。这使得研究人员得出结论较低剂量的NTAPP可引起体外培养的细胞发生“正效应”，如增殖、分泌细胞因子和胶原合成增加等，而较高剂量会导致体外培养的细胞出现一系列“负效应”，如细胞黏附能力降低、细胞通透性增加、细胞凋亡、细胞坏死等。

MSCs存在于多种组织之中，因其具有多向分化潜能、自我复制和促进受损组织修复等特点而日益受到人们的关注[14]。有研究表明，MSCs可分化发育成某种类型组织的细胞，参与组织的生长发育与修复，此外，MSCs还具有免疫调节作用和旁分泌效应。可见MSCs成为治疗多种疾病的理想种子细胞[15]。然而，在体外培养成体干细胞时，很难保证它们干性稳定存在，并且成体干细胞在体外会快速衰老，因此，找到NTAPP诱导间充质干细胞凋亡与增殖两者之间的最佳剂量可为干细胞的临床应用提供基础理论。

因此，试验采用真皮间充质干细胞（DMSCs）为研究对象，利用低温等离子体活化介质处理DMSCs，初步探讨低温等离子体活化介质使真皮间充质干细胞凋亡的条件，阐明低温等离子体活化介质诱导DMSCs凋亡的分子机制，为丰富低温等离子体在干细胞领域的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

小鼠原代真皮间充质干细胞DMSCs（来自129/SvJ小鼠）

1.1.2 药品与试剂

DMEM培养基（Hyclone公司）；F12培养基（Hy－Clone）；青链霉素混合液（100×）细胞培养专用（P/S）（北京索莱宝公司）；优级胎牛血清（FBS）（杭州四季青公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）不含酚红（T/E）（北京索莱宝公司）；表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF2（金斯瑞公司）。

1.2 方法

1.2.1 DMSCs的提取与培养

取新出生的2 d的小鼠，取75%酒精于50 mL离心管中，将小鼠放入其中2 min，取Hank’s+G于50 mL离心管中，将小鼠放入其中2 min，将小鼠取出，从颈部分离整块皮肤，将皮肤表皮朝上，真皮朝下平铺在3.5 cm培养皿中，加入2 m L Hank’s+G，4℃过夜。第2天将取下的皮肤平铺至新的3.5 cm培养皿中，向其加入2 mL T/E，平稳放入4℃冰箱4 h后，之后用镊子轻轻摘除皮肤下的脂肪，再置于T/E中，放入37℃培养箱消化1 h后，用镊子将表皮与真皮分开，用剪子将真皮组织尽可能剪碎，置于T/E中37℃水浴锅消化1 h，用ccm阻断，进行1200 rpm·min-1离心7 min，小心吸除上清，加入DMSCs专用培养基，吹打混匀后70 μm strainer过滤，再次1200 rpm·min-1离心7 min，小心弃掉上清，用5 mL DMSCs专用培养基重悬细胞球，种于6 cm培养皿，放入5%二氧化碳（CO2），37℃的恒温培养箱中培养，48 h后观察形态，待细胞密度达到80%时，1∶3传代。

1.2.2 DMSCs的鉴定

利用流式细胞术检测细胞表面标志物：回收细胞球，6 mL PBS重悬，分为6个1.5 mL Tube管，5 000 rpm离心3 min，弃上清，1%FCS重悬，分别加入1uL CD44、CD106、CD45、CD34、CD14荧光抗体，4℃孵育30 min，吹打混匀，转移至流式管，通过表达CD44和CD106及不表达CD45、CD34、CD14等指标，结合细胞形态对分离培养的DMSCs进行鉴定。

细胞分化能力检测：以DMEM+10% FBS+1 μm地塞米松+0.5 mM IBMX+10 μm牛胰岛素的条件下进行成脂诱导分化，通过油红O染色进行鉴定。以DMEM+10%FBS+1 μm地塞米松+10 mM-甘油磷酸钠的条件下进行成骨分化诱导，通过茜素红染色进行鉴定。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡

将细胞以每板以1.2×105个的细胞浓度种至6孔板皿中。使用低温等离子体活化介质处理分别真皮间充质干细胞0、10、30 s。在终止培养时，回收每孔中的细胞上清到做好标记的2 mL的Tube管中，随即加入200 uL胰酶，轻轻敲打6孔板，放入培养箱中孵育3 min，利用已经预热的DMSCs专用培养基对进行消化的细胞进行每孔1 mL的细胞阻断，使其停止消化。回收消化下的细胞悬液至做好标记的1.5 mL的Tube管中，进行5 000 rpm·min-1离心5 min，弃去上层液体。先向2.0 mL的Tube管中加入500 uL 1×Binding Buffer用来悬浮管底细胞，再将管中的全部溶液加入相同组别的1.5 mL的Tube管中，对管底细胞吹打混匀，全部吹打混匀后，分别从每管中取出90 uL，混匀后均分为三等份（将作为空白对照及单染对照）。向每管实验组中加入5 uL的Annexin V-APC染料，25℃避光孵育15 min。在结束孵育后，向每管补充PBS溶液至500 uL，轻轻混匀后转移至流式管中，注意标好每管组别后，进行流式细胞仪操作。结束后，拷贝数据进行分析。每组试验均重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测ROS

将细胞以每板以1.2×105个的细胞浓度种至6孔板中。培养12 h后。使用低温等离子体活化介质处理分别真皮间充质干细胞0、10、30 s，放入培养箱中培养12 h后，弃去培养液，PBS洗一遍，加入200 uL TE，轻轻敲打6孔板，放入培养箱中孵育3 min，加入1.8 mL CCM阻断，做好标记，回收至2 mL Tube管中，5 000 rpm·min-1离心3 min，弃去上清液。加入1 mL PBS进行重悬，5 000 rpm·min-1离心3 min，再次加入1 mL PBS进行重悬，每个离心管中加入1 uL 5umol·mL-1DCFH-DA染液（空白对照组不加入任何染料），二氧化碳培养箱中孵育15 min。用1 mL PBS清洗去除残留DCFH-DA染液，并用流式细胞术检测ROS水平。结束后，拷贝数据进行分析。每组试验均重复3次。

1.2.5 蛋白质印迹法分析凋亡相关蛋白表达量

利用低温等离子体活化介质分别处理DMSCs细胞0、10、30 s，放入培养箱中培养12 h后，回收细胞球进行离心，弃去上清后PBS溶液进行重悬，再次离心后弃去上清，液氮速冻后，放至-80℃超低温冰箱中冷冻备用。

将冷冻的样品取出（在冰上操作），向每管中加入50 uL细胞裂解液，将底部细胞吹打均匀，每间隔5 min对装有样品的Tube管进行漩涡震荡，在震荡6次后，在4℃环境下12 000 rpm·min-1离心30 min。在离心结束后，回收每管中的上清液到新的1.5 mL Tube管中并做好标记。配置蛋白质浓度检测稀释液（800 uL无菌去离子水、200 uL考马斯亮蓝溶液），并每组蛋白质样品加1 uL至稀释液中。检测在595 nm紫外分光光度计处的吸光值，通过该机器的吸光值标准曲线计算，配置蛋白质含量/体积为20 ug·15 uL-1，同时依据样品总体积的1/5加入5×SDS上样缓冲液，补充一定体积的蒸馏水至每组样品体积相同，进行震荡混匀。在煮沸5 min后立即置于冰上冷却待用。

首先对凝胶需要的玻璃板和陶瓷板进行清洗，并安装在其配套的模具中进行夹板操作并加入蒸馏水对其进行验漏操作，确保其密封程度后，加入刚配置好的12%浓度的分离胶（已确保在旋涡振荡器上进行震荡均匀）每板6 mL，并在板中上方的空余位置缓慢加入蒸馏水，确保胶面水平。静置40 min左右（确保分离胶完全凝固）后，倒去上层蒸馏水，并插入相对应的梳子。在梳子和玻璃板的空隙处加入刚刚配置好的5%浓度的浓缩胶后，将梳子下压至梳子上端和玻璃板上端水平即可，静置20 min左右（确保浓缩胶完全凝固）。拔出梳子，并将固定的模具打开取出胶板，清洗后将胶板固定在电泳槽中，向每组电泳槽中加入200 mL电泳液后，准备进行点样操作。首先向第一个孔内加入蛋白质标准预染Marker 5 μL，再向后续的孔中分别加入目的蛋白样品（点样过程尽量匀速而缓慢，从而避免样品弥散或产生气泡）。在加样完毕后，接通电泳槽电源（保持电压在140 V下进行电泳），在发现样品处于距离胶板下端0.5 cm时即可停止电泳。转膜需要准备滤纸和NC膜，取下胶板，用清水进行轻轻冲洗后取出中间的胶。以三明治结构（滤纸、硝酸纤维素膜、胶、滤纸）夹在夹子中，装入转膜桶。连接好电源，放入4℃冰箱中，在130 mA的电流下转膜6 h。转膜完成取出已经转上蛋白质的NC膜，并把膜放入0.1%的丽春红染液中预染3 min，根据实验所需的位置进行剪裁，利用TBST溶液5 min·次-1清洗3次，洗净丽春红染液在膜上的残留。配制适当体积5%的脱脂奶粉，洗膜盒中加入5%的脱脂奶粉进行封闭，放到摇床进行低速摇晃，孵育1 h。将脱脂乳弃去后，再利用TBST进行洗膜，每次5 min一共清洗5遍，最后一遍时弃去TBST加入相应一抗并做好对应标记，放在摇床上，4℃孵育12 h。一抗孵育结束后弃去一抗，用TBST进行洗膜5遍，每遍5 min。最后一遍时弃去TBST加入5 mL的5%的脱脂奶粉，置于摇床上封闭10 min后，向脱脂奶粉中加入相对应的二抗，室温孵育2 h。二抗孵育结束后去掉脱脂奶粉，利用TBST进行洗膜，每次5 min，一共洗5遍。并配制ECL超敏发光化学底物（A液与B液1∶1混合后震荡混匀，按照每张膜200 μl的体积进行配置），避光保存。利用美国GEAI 600超敏多功能成像仪，进行显影曝光，保存数据。

1.2.6 统计学分析

数据均以′x±s表示，采用SPSS11.0软件进行统计学分析，所有结果以均值±标准差表示，两组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。每组试验均至少重复3次。

2 结果与分析

2.1 真皮间充质干细胞（DMSCs）的分离培养及鉴定

根据2006年间充质组织干细胞委员会规定的间充质干细胞标准，采用流式细胞术检测细胞表面标志物的表达情况，结果显示，所提取的细胞不表达CD34，CD45，CD14，但所提取的细胞CD44，CD106强烈表达（图1A）。同时为了鉴定所提取的细胞是否具有分化能力，采用成脂分化及成骨分化的诱导培养基培养细胞，油红O和茜素红染色结果表明，所提取的细胞可以定向分化为脂肪细胞（图1B）及骨细胞（图1C），证明所提取的细胞具有分化潜能。结合以上结果表明提取的细胞为纯度较高的真皮间充质干细胞，可以用于后续实验。

图1 真皮间充质干细胞的分离培养及鉴定Fig.1 Isolation，culture and identification of DMSCs

2.2 低温等离子体活化介质PAM诱导DMSCs细胞凋亡

为了探究低温等离子体照射对DMSCs的影响，采用NTAPP射流装置如图A所示，处理条件为放电电压16 kV，高纯氩气流量1 L·min-1，培养基液面与NTAPP管口距离1.3 cm。试验将装有培养基的细胞培养皿放置在NTAPP射流下方分别处理10、30，处理后的培养基即为PAM，使用PAM培养DMSCs，12 h后，通过流式细胞术检测细胞凋亡情况（图2B、C），结果表明，与未处理组相比，PAM处理10、30 s后，DMSCs细胞凋亡明显升高。图D是图C的定量分析。

图2 低温等离子体活化介质PAM诱导DMSCs细胞凋亡Fig.2 PAM induced apoptosis of DMSCs

2.3 低温等离子体活化介质PAM可以增加DMSCs细胞内ROS水平

众所周知，活性氧（ROS）是体外NTAPP诱导的细胞凋亡的主要参与者，为了确定PAM是否是通过改变细胞内ROS水平诱导细胞发生凋亡的。通过不同时间的PAM（0、10、30 s）处理DMSCs细胞24 h，检测细胞内的ROS表达水平，利用DCFH-DA单染检测DMSCs细胞内产生的ROS水平（图3A、B）。结果显示，随着处理时间的增加，DCFH-DA发出的绿色荧光强度显著增加这证明了细胞内ROS水平明显增加。图C是图B的定量分析。

图3 低温等离子体活化介质PAM可以增加DMSCs细胞内ROS水平Fig.3 PAM increased the ROS level in DMSCs

2.4 低温等离子体活化介质PAM处理DMSCs后凋亡蛋白和抗氧化蛋白的表达情况

为了进一步证明PAM诱导DMSCs发生凋亡，利用蛋白免疫印迹法检测不同时间（0、10、30 s）PAM处理DMSCs细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl2表达水平（图4A）。结果表明，与未处理组相比，PAM处理后Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bax表达水平明显增加，同时伴随着抗凋亡蛋白Bcl2表达水平明显下降。进一步通过蛋白免疫印迹法检测不同时间（0、10、30 s）PAM处理DMSCs细胞抗氧化相关蛋白Prx I、Prx V、GPX表达水平，结果表明，与未处理组相比，PAM处理后Prx I、Prx V、GPX表达水平明显升高（图4A）。图B是图A的定量分析。

图4 低温等离子体活化介质PAM处理DMSCs后凋亡蛋白和抗氧化蛋白的表达情况Fig.4 Expression of apoptotic proteins and antioxidant proteins after PAM treatment of DMSCs

3 讨论

近年来，人们对NTAPP的临床应用进行了研究，特别是在癌症治疗和灭菌方面[16]。虽然已知NTAPP可诱导多种癌细胞凋亡，但其抗肿瘤作用的分子机制仍不明确。NTAPP引起NTAPP源性ROS增高而致细胞损伤是目前关注的焦点。细胞内抗氧化系统被ROS过度消耗导致抗氧化系统失衡是细胞损伤的主要原因，且ROS导致DNA和线粒体损伤[17-21]，也有研究显示，NTAPP在保持脂肪间充质干细胞ASCs干细胞特性的同时，可以促进ASCs的增殖。且NTAPP生成的一氧化氮（NO）通过激活Akt和ERK1/2通路在NTAPP诱导的ASCs增殖增加中发挥了关键作用[22]。可见，NTAPP对细胞的作用是一种多因素的综合效应。

在研究中，使用了一种氩气介质放电型NTAPP装置，采用PAM间接处理DMSCs，探究PAM对DMSCs活性的影响，研究结果显示，一定剂量的PAM可以上调细胞内ROS水平诱导DMSCs发生凋亡，并且发现在这过程中抗氧化酶Prx I、Prx V、GPX表达水平明显升高，在之前的研究中，沉默Prx V基因能够促进顺铂诱导的HepG2凋亡[23]，此外，Prx I敲除通过ROS-p38 MAPK信号通路促进皮肤肿瘤模型中角质形成细胞凋亡[24]，可见抗氧化蛋白在PAM诱导的DMSCs细胞凋亡中发挥重要，但其具体机制有待进一步阐明。

综上所述，试验初步证明了PAM可以上调细胞内ROS水平诱导DMSCs发生凋亡，为今后筛选PAM诱导DMSCs增殖的最佳条件提供前期结果，也为临床干细胞移植治疗阿尔兹海默症、糖尿病、急性肺损伤等疾病提供基础理论。