木霉菌拌种处理对绿豆根际土壤酶活性的影响

郝韵寒，靳亚忠

（黑龙江八一农垦大学园艺园林学院，大庆 163319）

绿豆（Vigna radiata（Linn.）），一种重要的药食同源作物[1]，富含有丰富的优质蛋白、氨基酸、多种维生素、矿物质和多糖、黄酮类物质、苯丙氨酸解氨酶、超氧化歧化酶、胰蛋白酶抑制剂、抗性淀粉、抗真菌蛋白等多种活性物质[2-4]，被广泛应用于医药业、酿造业和食品业等[4]。绿豆是中国重要的小杂粮作物之一，种植面积达到75万hm2,主要分布在东北与华北等地[5]，且随着绿豆种植面积的扩大，连年重茬栽培易导致绿豆根腐病、枯萎病以及叶斑等病害的发生[1]，而生产中多采用化学药剂进行绿豆全生育期的病害预防或防治[6-7]。此外，在我国的绿豆生产中，过量使用化学肥料也导致了系列环境问题[8]，但绿豆的产量并没呈现最高[5,9-11]。因此，如何降低化肥以及化学农药的投入量，已经引起广大研究者的广泛关注；必须实行适宜的农业生物技术手段干预有限耕地下生产最大量的粮食作物，而以微生物的干预作为一种生产中减肥减药的方式逐渐被种植者接受。

木霉菌（Trichoderma spp.)是一类丝状子囊菌类、绿色孢子真菌，广泛存在于自然界中,已经作为一种生物菌在农业上广泛应用。木霉菌能与植物和谐共生，对植物的生长和养分吸收、系统抗逆性以及病害防治具有重要的影响[12]。然而，木霉菌的使用方式（如种子包衣、根系和土壤处理）、接种量大小、土壤环境条件、木霉菌种类等都影响着植物的生长发育[13]。木霉菌与植物互作中，木霉菌对植物的促生调节与木霉菌分泌的微粒物质或木霉菌对植株根际土壤微生物环境的调节和对土壤营养元素有效性的调节等相关[14]。在辣椒研究中，化肥减量30%和50%配施木霉菌有机肥提高了根际土壤中土壤蔗糖酶、多酚氧化酶、脱氢酶、脲酶、碱性磷酸酶活性以及土壤中有效氮磷钾的含量[15]；在生菜和高丛越橘的研究中，等氮量条件下，木霉菌有机肥的使用也促进了对土壤酶活性的升高[16-17]。但是，木霉菌菌剂接种于植物根部对土壤中酶活性的影响报道较少。本课题组前期在绿豆和蔬菜育苗研究中，木霉菌种子包衣能促进植株生长[18-19]，是否与木霉菌种子包衣参与调节土壤酶活性相关，还不清楚。因此，研究分析不同用量木霉菌孢子粉进行绿豆种子包衣对绿豆根际土壤酶活性的影响，所得结果对绿豆栽培及绿色防控具有重要意义，同时也为木霉菌的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

栽培试验品种为黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心提供的小明绿，木霉菌剂由黑龙江田力保生物科技有限公司提供。

1.2 试验设计

该试验采用基质栽培方式进行，在直径为40 cm、高度为30 cm的桶中栽培，基质为混合基质，以沙子、草炭土，按照1∶2混配而成。试验设置5个处理，菌剂与绿豆种子按照质量比进行拌种，分别为：0%（CK）、0.5%（A）、1%（B）、2%（C）、3%（D），每个处理3次重复。播种前一天对已装有基质的塑料桶进行浇水，将挑选的颗粒饱满、大小一致的绿豆种子浸泡后，控水至种皮湿润，可进行木霉菌剂拌种，每盆点播7粒颗粒饱满的种子。待出苗整齐后间苗，每盆留3株长势均匀的植株进行培养。间苗后，一次性定量施入20 g氮磷钾复合肥（N-P2O5-K2O=20-20-20）/桶（黑龙江牧康牧业有限责任公司提供）；后期栽培过程中，进行常规的栽培管理。

表1 供试基质基本理化形状Table 1 Principal physical and chemical properties of tested substrates

1.3 测定指标与方法

利用小铁铲挖出绿豆植株，去掉根系浮土，用毛刷刷取紧密附着在根系上土壤作为根际土壤，装入自封袋，放置在-80℃冰箱中保存，用于测定土壤酶活性。土壤脲酶采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定，单位为NH3-N mg·g-1[20]；土壤碱性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定，单位为（酚）mg·g-1[20]；土壤蔗糖酶采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定，单位为（葡萄糖）mg·g-1[20]；土壤脱氢酶采用TTC分光光度法测定,单位为（TPF）μg·g-1[20]；土壤过氧化氢酶采用比色法测定,单位为（KMnO4）mL·g-1[20]；土壤蛋白酶活性采用茚三酮比色法测定进行测定,单位为（甘氨酸）μg·g-1[20]。

1.4 数据处理

采用Excel 2010和SPSS.19软件对数据进行处理和统计分析，采用Duncan新复极差法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 木霉菌拌种对绿豆根际土壤脱氢酶活性的影响

由表2可知，利用木霉菌进行绿豆拌种，能够调节绿豆根际土壤中脱氢酶的活性，且随着木霉菌用量的增加土壤脱氢酶活性呈现升高—降低趋势。与对照（CK）相比，不同用量的木霉菌进行绿豆种子包衣明显促进了绿豆根际土壤脱氢酶活性，而木霉菌处理的绿豆根际土壤脱氢酶活性之间存在差异（P<0.05）。在绿豆开花期和成熟期，0.5%（A）处理的绿豆根际土壤脱氢酶活性显著大于3%（D）处理，而0.5%（A）、1%（B）、2%（C）处理之间无明显差异（P<0.05）；在结荚期，B（1%）处理的绿豆根际土壤脱氢酶活性明显高于其他处理（P<0.05）。

表2 木霉菌拌种对绿豆根际土壤脱氢酶活性的影响Table 2 Effects of Trichoderma SPP.on dehydrogenase activity in rhizosphere soil of mung bean

2.2 木霉菌拌种对绿豆根际土壤碱性磷酸酶活性的影响

由表3可以看出，绿豆不同的生长发育期，木霉菌处理对绿豆根际土壤碱性磷酸酶活性影响存在差异。在开花期和结荚期，木霉菌拌种处理的辣椒根际土壤碱性磷酸酶活性高于对照（CK），差异显著（P<0.05），而木霉菌拌种处理之间相比，绿豆根际土壤碱性磷酸酶活性也存在差异，且在开花期，C处理绿豆根际土壤碱性磷酸酶活性显著高于其他处理，而在结荚期，C和D处理土壤碱性磷酸酶活性之间无明显差异，但明显高于A和B处理（P<0.05）。此外，在成熟期，C处理的绿豆根际土壤碱性磷酸酶活性明显大于与对照（CK）和A、B、D处理，但A和B处理的土壤碱性磷酸酶活性则显著低于C处理（P<0.05）。

表3 木霉菌拌种对绿豆根际土壤碱性磷酸酶活性的影响Table 3 Effects of Trichoderma SPP.on phosphatase activity in rhizosphere soil of mung bean

2.3 木霉菌拌种对绿豆根际土壤蔗糖酶活性的影响

木霉菌拌种处理影响了绿豆根际土壤蔗糖酶的活性（表4）。从表4可以看出，随着木霉菌拌种量的增加，在绿豆生长发育的不同时期，根际土壤蔗糖酶活性随着木霉菌用量的增加呈现出升高-减低的变化趋势。与CK相比较，在绿豆生长发育的3时期，A（0.5%）、B（1%）、2%（C）、D（3%）处理的绿豆根际土壤蔗糖酶活性都明显高于CK处理，而木霉菌拌种处理之间相比较，发现在这3个时期，C（2%）处理的绿豆根际土壤蔗糖酶活性都明显大于其他木霉菌处理（P<0.05）。

表4 木霉菌对绿豆植株根际土壤蔗糖酶活性的影响Table 4 Effects of Trichoderma SPP.on sucrase activity in rhizosphere soil of mung bean

2.4 木霉菌用量对绿豆植株根际土壤脲酶活性的影响

脲酶活性的大小反映了土壤中有效态氮素的可利用性。由表5可知，在绿豆生长发育的开花期、结荚期以及成熟期，0.5%（A）、1%（B）、2%（C）、3%（D）处理的绿豆根际土壤脲酶活性显著高于对照（CK）处理（P<0.05），且随着木霉菌拌种用量的增加，绿豆根际土壤脲酶活性呈现为现升高而后降低趋势；在绿豆的开花期和结荚期，木霉菌拌种处理之间相比，1%（B）处理的绿豆土壤根际脲酶活性明显大于其他处理（P<0.05），而在绿豆成熟期，2%（C）处理的脲酶活性显著高于对照（CK）和其他木灭菌处理，而0.5%（A）和3%（D）处理之间无明显差异（P<0.05）。

表5 木霉菌对绿豆植株根际土壤脲酶活性的影响Table 5 Effects of Trichoderma SPP.on urease activity in rhizosphere soil of mung bean

2.5 木霉菌用量对绿豆植株根系土壤过氧化氢酶活性的影响

由表6可知，与CK相比较，在绿豆生长发育的3个时期，木霉菌拌种处理的绿豆根际土壤过氧化氢酶活性也明显高于CK处理（结荚期A处理除外）；随着木霉菌拌种用量的增加，绿豆根际土壤中过氧化氢酶活性逐渐增大，3%（D）处理根际土壤过氧化氢酶活性最高，显著高于其他木霉菌处理，而其他木霉菌处理之间无明显差异（P<0.05）。在结荚期，A（0.5%）处理的根际土壤过氧化氢酶与对照（CK）无显著差异，但其明显低于其他木霉菌处理，而B和C处理之间无明差异（P<0.05）。成熟期，A和B处理土壤根际过氧化氢酶活性显著低于C和D处理，而二者之间无显著差异（P<0.05）。

表6 木霉菌对绿豆植株根系土过氧化氢酶活性的影响Table 6 Effects of Trichoderma SPP.on catalase activity in rhizosphere soil of mung bean

2.6 木霉菌用量对绿豆植株根际土壤蛋白酶活性的影响

由表7可以看出，与对照（CK）相比较，木霉菌菌剂拌种处理后，在绿豆生长发育的开花期，A和D处理的绿豆根际土壤的蛋白酶活性与CK处理之间无明显差异，而B和C处理的绿豆根际土壤蛋白酶活性大于CK处理，而与其他木霉菌处理之间无明显差异（P<0.05）。在绿豆生长发育的结荚期和成熟期，木霉菌拌种处理绿豆根际土壤的蛋白酶活性随着木霉菌用量的增加呈现升高-降低趋势，且C（2%）处理土壤蛋白酶活性最高，显著大于CK和其他木霉菌处理（P<0.05），而在结荚期，A、B和D处理土壤蛋白酶活性之间无明显差异（P<0.05）。

表7 木霉菌对绿豆植株根际土壤蛋白酶活性的影响Table 7 Effects of Trichoderma SPP.on activity in rhizosphere soil of mung bean

3 讨论

木霉菌定殖于植物根系，是促进植物生长和调节植物防御性能的一种方式。在定殖于根系的作用过程中，木霉菌分泌的蛋白、激素、次生代谢物、水解酶类、杂环类物质以及抗菌素类物质等多种活性物质发挥着活化土壤养分、促生等作用[13,21]。李氏木酶菌能产生高效的多酶体系，能调节栽培基质中腐殖质或有机质的含量，形成多糖物质，为根系提供碳源，促进植物根系的生长[22]。但是，木霉菌菌剂拌种或接种于植物根际土壤能否影响土壤酶活性，进而间接促进植物生长的报道较少。本研究中，按照木霉菌菌剂与种子质量比为0.5%（A）、1%（B）、2%（C）、3%（D）进行种子包衣处理都促进了绿豆植株根际土壤中脲酶、磷酸酶、蔗糖酶、脱氢酶、过氧化氢酶以及蛋白酶活性的增高，而调节酶活性升高的效果则存在处理间以及绿豆发育期的不同。在大豆的研究中，根部接种短密木霉菌促进了蔗糖酶活性的增加，而过氧化氢酶活性随着培养时间的推移城乡升高-降低-升高的趋势[23]，与本研究结果存在有相同和有异之处，可能由于作物种类不同而产生了不同调节结果。本课题组在前期的研究中发现，木霉菌菌剂对绿豆种子包衣能促进绿豆植株的生长发育，因此推测木霉菌菌剂包衣处理绿豆种子可通过调节绿豆根际土壤酶活性进而间接发挥促生作用，且发现，1%~2%用量的木霉菌菌剂包衣绿豆种子调节植株根际土壤酶活性的效果突出，而3%处理则导致根系过氧化氢酶活性升高，可能造成了胁迫作用，还需进一步研究。此外，木霉菌有机肥与化肥配施能通过促进绿豆植株根际土壤碱性磷酸酶、脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶、脱氢酶等活性的升高，促进了植株生长[15]，而在生菜研究中，也发现木霉菌有机肥与化肥配施提高了根际土壤中土壤中性磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性，而降低了脲酶和脱氢酶活性，促进了根际土壤中有效养分含量[20]；另外，木霉菌生物有机肥和有机肥处理提高了高丛越橘根际土壤中酸性磷酸酶和脲酶活性[17]；前人的研究结果暗示了木霉菌的应用对不同作物根际土壤酶活性的调节不同，可能与木霉菌的菌种、作物种类以及使用方法等存在关系。在研究中，木霉菌菌剂包衣处理对绿豆根际土壤酶活性的调节与在大豆中[20]的研究也存在不同，可能与木霉菌的使用方式不同有关，还需进一步进行研究。

4 结论

研究发现，采用木霉菌与种子质量比为0.5%（A）、1%（B）、2%（C）、3%（D）拌种处理，发现能促进绿豆开花期、结荚期和成熟期根际土壤中的脱氢酶、磷酸酶、蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶以及蛋白酶的活性的提高，但存在木霉菌用量之间的差异，且随着木霉菌用量的增加，土壤中这些酶活性呈现升高-降低趋势（过氧化氢酶活性除外）；2%（C）木霉菌用量拌种处理绿豆，其根际土壤处理脱氢酶、磷酸酶、蔗糖酶以及蛋白酶活性最高，且促进了成熟期土壤脲酶的增加，而1%（B）木霉菌拌种处理促进了开花期和结荚期土壤脲酶的升高。此外，发现随着木霉菌菌剂用量的增加，拌种处理绿豆根际土壤过氧化氢酶活性逐渐增大，且3%（D）木霉菌菌剂拌种处理的土壤过氧化氢酶活性最高，说明木霉菌菌剂拌种绿豆种子，能够通过调节根际土壤各种代谢酶活性，但使用量过大能抑制脱氢酶、磷酸酶、蔗糖酶、脲酶以及蛋白酶的活性升高，并促进胁迫响应关键酶-过氧化氢酶活性的增加。