关防风多糖提取工艺参数的优化

刘思雯，万轩辰，徐建芳，于浪潮，韦春波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院/黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室，大庆 163319）

防风[Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk]是伞形科植物，防风的未抽花干燥根，其味辛、甘、微温，可祛风解表，止痛止痉[1-2]。防风作为一种传统的中草药，含有多糖、色原酮、香豆素等多类活性物质，广泛分布于中国的北部和东北部地区，并在安徽、山西和甘肃等其他地区有较大面积栽培，常被用以治疗头痛、中风、过敏性鼻炎等临床症状[3-4]。现代研究表明，防风中多糖类成分可有效提高免疫力，具有抗肿瘤、抗癌、抗菌、抗氧化性等多种理化活性作用，具有广阔的开发前景[5-6]。由于多糖的化学结构较为独特，使得防风中的多糖类成分难以提取及分离。因此，多糖提取技术的研究对防风药材资源的开发利用具有重要意义[7-8]。

防风多糖作为一种天然聚合物，在防风植物细胞壁中普遍存在。由于我国严禁在动物体内使用抗生素类产品，因此找到和抗生素同等功效的替代品成了当下畜牧产业的热度之一。在对抗生素替代品的研究过程中，经查阅大量文献证明，防风多糖作为一种天然的免疫活性物质，有着多种生物学特性，用在饲料中同样可提高畜禽的免疫力，因此完全有可能替代抗生素在饲料中的作用[9]。根据前人大量研究表明，防风中的有效成分：防风多糖，能够有效抑制肿瘤细胞的生长，对动物体进行免疫调节，从而达到增强自身免疫作用的效果[10]。在小鼠的异种移植模型中，DING J X研究了防风多糖对U937、MCF-7以及MDA-MB-231肿瘤生长的影响，其结果显示多糖可以促进U937生长，并间接抑制MDA-MB-231来源SCID小鼠的肿瘤生长，但体外对MCF-7和MDAMB-231无明显的抑制作用，据此推断防风多糖是一种可针对乳腺癌的抗癌药物[11]。

防风中多糖的提取工艺较多，囊括水蒸气蒸馏法，回流提取法，超声提取以及微波辅助提取法等。其中，水蒸气法及回流提取法操作较为简单方便被广泛使用，但也存在着提取效率低下、耗时长等缺点。而更现代化的一些提取工艺，提取效率高，耗时短，但因其费用较大导致并未投入大规模的生产中，没有被广泛使用[12]。目前国内外关于防风多糖提取工艺的系统研究较少，传统方法在提取工艺上略有欠佳，存在耗时长、提取效率低等亟待解决的瓶颈问题。因此，本研究以黑龙江省关防风为实验材料，利用响应面分析设计优化关防风多糖的提取工艺，采用超声辅助水提醇沉法优化筛选最佳提取工艺参数，为未来防风多糖的提取利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器设备

试验材料：黑龙江省关防风；葡萄糖（标准品）；苯酚（分析纯）；浓硫酸（分析纯）。

试验主要设备见表1。

表1 主要仪器Table 1 The main equipment of the experiment

1.2 试验方法

1.2.1 关防风多糖的提取方法

试验前先对关防风进行清洗，表面无明显杂质后再将洗过的防风放入55℃烘箱内烘干3 h。烘干后的关防风用植物根茎粉碎机进行打磨粉碎，然后将粉末放入药典2号筛中备用。

精确称量关防风粉末5 g（误差小于0.001），按照液料比例加入一定量的蒸馏水，通过调整合适的超声波清洗机的温度后，将提取物按照预定的超声波温度和超声波时间进行提取[13]。超声结束后再将提取物转移至离心管内。将提取物放入50 mL离心管中，随即进行调平离心，离心转速选择6 000 r·min-1，离心时间设置为10 min，并对离心管上清液进行过滤弃渣，过滤时将纱布加厚至32层，充分过滤之后将提取液经过旋转蒸发，直至体积浓缩至50 mL。加入1/4体积的无水乙醇进行醇沉处理，静置时间不少于12 h[14]。将醇沉后的上清液丢弃之后继续进行离心。将离心的转速设置为6 000 r·min-1，离心时间选择10 min，离心温度调整为25℃，离心结束后采用55℃烘箱进行多次烘干处理达到恒重，从而得到关防风粗多糖。

1.2.2 单因素试验

为明确不同液料比、超声温度和超声时间对关防风多糖提取率的影响情况，采用单因素试验设计进行研究，每个因素设置五个水平，每个水平重复试验3次。试验全程控制变量，来探究单个因素对关防风多糖提取率的影响。其默认提取参数为液料比40∶1、超声温度60℃、超声时间40 min。具体因素及水平选取情况见表2所示。

表2 单因素水平表Table 2 Level table of single factor

1.2.3 响应面优化试验

根据单因素试验结果，比较各水平提取率的大小关系。选定各因素中多糖提取率最大的水平进行后续的响应面优化试验。其中每个因素选择三个水平，响应面优化因素水平编码表见表3所示。根据表3编码情况，使用Design Expert 12中Box-Behnken法进行试验设计并优化[15]。

表3 响应面优化因素水平编码表Table 3 Response surface optimization factor level coding table

1.2.4 关防风多糖提取率的测定

由于防风粗多糖中含有较多杂质，采用苯酚-硫酸法测定关防风粗多糖的含量，并构建标准曲线计算防风多糖的提取率[16]。

（1）葡萄糖标准曲线的构建

精确称取10 mg无水葡萄糖，精确定容至100 mL，摇匀后备用。

准 确 量 取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL葡萄糖标准溶液，将其分别置于10 mL的具塞试管中，各加入蒸馏水补至1.0 mL，再加入6%的苯酚试样0.5 mL，浓硫酸5.0 mL，充分摇匀后静置冷却至室温[17]。在最大吸收波长490 nm波长下进行各溶液吸光度的测定[18]。横坐标为葡萄糖的浓度，纵坐标为吸光度，根据数据绘制出葡萄糖标准曲线（图1），再将数据进行处理后得到标准曲线方程如下：

图1 总糖含量标准曲线Fig.1 Standard curve of total sugar

（2）计算提取率

精确称取关防风粗多糖10 mg于100 mL容量瓶中，定容后从容量瓶内准确吸取1 mL溶液加入具塞试管中，向其依次加入6%的苯酚溶液0.5 mL和浓硫酸5.0 mL，摇匀后冷却至室温，测定490 nm波长下的吸光度。按照公式（2）计算关防风中多糖的含量：

式中Mp为多糖含量，单位g；Me为粗多糖含量，单位g；Mcv为100 mL定容多糖用量，单位mg；Ms为取样的防风重量，单位g；A表示吸光度，a为标准曲线的斜率，b为标准曲线的截距。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 液料比对关防风多糖的提取率的影响

固定超声温度为60℃和超声时间40 min下，液料比对关防风多糖提取率的影响如图2所示。

由图2可以看出，关防风中多糖的提取率会根据溶剂量的加大而产生明显的提高，在液料比不断增大的情况下，液料比在40∶1时关防风多糖的提取率在1.045%达到最大，随后出现回落。原因可能是在温度的不断升高的情况下多糖会产生不耐受现象，进而影响对关防风多糖的提取。

图2 液料比对关防风多糖提取率的影响Fig.2 Effects of different liquid solid ratio on extraction rate of SDP

2.1.2 超声温度对关防风多糖的提取率的影响

在固定液料比40∶1和超声温度60℃下，超声温度对多糖提取率的影响如图3所示，从图中可以看出，在超声温度不断升高的情况下，关防风多糖的提取率呈现先升高后降低的趋势，但是防风多糖提取率在各组之间并未存在显著差异。其中超声温度为60℃下关防风多糖的提取率最高为0.907%。

图3 超声温度对防风多糖提取率的影响Fig.3 Effects of ultrasonic temperature on extraction rate of SDP

2.1.3 超声时间对关防风多糖提取率的影响

固定液料比40∶1和超声温度60℃下，超声时间对黑龙江关防风多糖的提取率影响如图4所示。

图4 超声时间对防风多糖提取率的影响Fig.4 Effects of different ultrasonic time on extraction rate of SDP

在超声时间的不断延长的情况下，关防风多糖的提取率呈现出先升高后降低的趋势，并且超声时间在60 min和70 min组的提取率明显高于其他组。当超声时间为60 min时，提取率最高为0.7699%。

2.2 响应面优化关防风多糖提取工艺参数

2.2.1 响应面试验结果

根据单因素试验结果，通过软件设计并开展了以提取率（Y）为考察指标，以液料比（A）、超声温为自变量的响应面优化试验，具体试验设计方案及结果见表4所示。

表4 响应面试验设计方案及结果Table 4 Design scheme and results of response surface test

通过分析实验数据，建立提取率（Y）与液料比（A）、超声温度（B）超声时间（C）之间的二次多项式：Y=1.03+0.02334-0.0202B-0.0129C-0.0008AB+0.0166AC-0.0386BC-0.1475A2-0.1683B2-0.0405C2

通过对响应面模型进行方差分析，具体结果见表5，可知多项式模型中F＝31.06（P＜0.01），说明了不同因素与响应值之间存在非常明显的线性关系，显著度较高。失拟项不显著（P>0.05），说明该模型通过失拟检验，拟合程度较好可以用于后续最佳提取参数的预测。其中，相关系数（R2）为0.9756，矫正系数为0.9442，即该模型的拟合程度较好。

表5 关防风多糖提取工艺响应面回归模型方差分析Table 5 ANOVA of response surface regression model for extraction of SDP

由图5所示，响应面图像开口均向下，表明该模型有中心最高点，这与试验结果一致。通过对响应面模型中锋面的陡峭程度以及对等高线的形状进行判断，各因素之间交互作用的强弱可以被看出，其中因素AB、AC等高线接近于圆形，表明交互作用较弱，与方差分析结果吻合（P>0.05）。

图5 响应面交互作用图及等高线图Fig.5 Response surface interaction diagram and contour map

2.2.2 优化提取参数

采用Design-Expert 12.0软件，按照表6设置参数限制并求出关防风多糖的最优工艺参数。得出最优工艺条件为：液料比40.7∶1、超声温度59.539℃、超声时间58.780 min。在优化后的提取条件下，提取率达到了1.036%，置信度为96.1%。因此，在实际操作下选取液料比41∶1、超声温度为60℃、超声时间59 min作为最优提取参数。

表6 参数优化限制Table 6 Parameter optimization limitation

3 讨论

通过比较不同比例、超声温度和超声时间对关防风提取率影响的实验研究发现，关防风中多糖的提取率会根据溶剂量的加大而产生明显的提高，由图2可以看出液料比例在40∶1时多糖的提取率达到峰值，随后又逐渐降低。通过分析可知溶剂中蒸馏水所占比例偏高导致细胞内物质的流出，进而提取率出现回落。而温度达到50℃后随着温度的增高，多糖提取率不增加，很有可能是温度过高破坏了多糖的活性，使多糖出现分解[19]。由于影响超声提取的因素较多，因此在试验过程中操作要精确，超声提取时温度不可过高[20]。同时，通过查阅大量资料表明，由于防风的品种及产地不同可导致最佳提取参数出现差异性，试验以关防风为实验材料，采用响应优化实验确定出最优工艺参数，为防风多糖的高效提取奠定了科学理论依据。

4 结论

基于单因素试验的结果，将响应面法优化设计与黑龙江关防风多糖的提取试验相结合，建立了其数学模型，该模型为二次多项式，且拟合程度较好。根据模型可以看出，在三个不同因素中，液料比对关防风多糖的提取率有着影响效果最明显，其次是超声时温度，而超声时间不同对提取率的影响不大。经过优化后关防风多糖的最佳工艺参数为液料比41∶1、超声温度为60℃、超声时间59 min。在此条件下得到关防风多糖的提取率为1.036%，置信度为96.1%,证明该模型有较高的可信度。该试验为今后进一步研究防风多糖的抗氧化、增强免疫力等功效提供了前期基础。