PBK/TOPK表达与老年急性髓系白血病患者治疗反应和生存预后的关联分析

吴文萍， 徐林娟， 王佳亨， 张娜娜

（衢州市人民医院血液科，浙江 衢州 324000）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种恶性血液系统克隆性肿瘤，具有高度异质性，临床表现为骨髓原始细胞异常累积和正常血细胞生成障碍[1]，是成人急性白血病中最常见的类型，发病率随年龄的增长逐渐增高，我国老年AML患者（≥60岁）发病年龄约为67岁[2]。吸烟、病毒感染、长时间辐射暴露等均可能诱发AML[3]。目前，老年AML患者的临床治疗主要包括“3+7”基础化疗方案、低强度治疗和支持治疗，但由于老年AML患者脏器功能差、合并症多、不良遗传核型等多种不良预后因素，其5年存活率仅为5%～10%[4-5]。

PBK/TOPK是由激酶亚结构域和锌指结合域组成的丝-苏氨酸激酶，在有丝分裂期间活化和磷酸化，属MAP-KK分子家族成员[6-7]。近年来的研究发现，PBK/TOPK在淋巴瘤、白血病、乳腺癌、黑色素瘤中高表达，在除睾丸生殖细胞和胎儿组织外的正常组织中无法检出，与恶性肿瘤细胞的增殖和扩散有关[8]。然而，关于PBK/TOPK表达与老年AML患者治疗反应和生存预后的关系鲜有报道。本研究以老年AML患者为研究对象，通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测PBK/TOPK在老年AML患者骨髓单个核细胞中的表达水平，评估其与患者临床特征和预后的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2016年7月—2017年3月于衢州市人民医院住院治疗的老年AML患者80例（AML组），其中男48例、女32例，年龄（69.8±6.5）岁，均依据世界卫生组织分型诊断标准[9]确诊。排除标准：（1）年龄<60周岁；（2）患急性早幼粒细胞白血病、继发性或治疗相关急性髓系白血病；（3）AML复发；（4）接受过化疗或其他治疗；（5）合并精神疾病、严重肝脏疾病、肾脏疾病或自身免疫系统疾病；（6）美国东部肿瘤协作组（the Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）体能状态评分（performance status，PS）>4分。

另选取同期衢州市人民医院行骨髓穿刺活检的≥60岁非恶性血液疾病患者32例作为对照组，其中男19例、女13例，年龄（67.91±5.89）岁。本研究经衢州市人民医院伦理审查委员会批准（伦理审批号：20160225），所有患者及其家属均知情并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基本信息收集 收集AML患者年龄、性别、外周血血红蛋白（hemoglobin，Hb）、白细胞（white blood cell，WBC）计数、血小板（platelet，PLT）计数、法美英（French-America-British，FAB）分型、染色体核型、基因突变类型、骨髓原始细胞比例、外周血原始细胞比例等临床资料。

1.2.2 样本采集 采集所有患者入院后治疗前骨髓样本和外周血各2～3 mL。骨髓样本采用肝素抗凝，在15 mL离心管中加入人淋巴细胞分离液后加入样本，447×g离心20 min，分离骨髓单个核细胞，-80 ℃冷冻保存。外周血样本离心后分离血清，冷冻保存。

1.2.3 主要仪器与试剂 Trizol试剂盒（日本TaKaRa公司），ReverTraAce qPCR RT Kit和SYBR Gene Realtime PCR Master Mix（日本Toyobo公司），CFX96型荧光定量PCR仪（美国Bio-RAD公司），DanoDrop 1000超微量蛋白核酸分析仪（美国ThermoFisher Scientific公司），引物由生工生物工程（上海）有限公司设计并合成，人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限公司。血液检测均由衢州市人民医院血液病研究部完成。

1.2.4 PBK/TOPK表达的检测 将冻存的单个核细胞37 ℃水浴复苏，按Trizol试剂盒说明书要求提取骨髓单个核细胞总RNA，将RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行RT-qPCR。PBK/TOPK正向引物序列为5'-GAGAGTGGCTTTCACAATGGA-3'，反向引物序列为5'-GGCCGGGATATTTATAGTTGGA-3'；β-actin正向引物序列为5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，反向引物序列为5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。反应条件：90 ℃5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃5 min。采用2-ΔΔCt法计算PBK/TOPK mRNA相对表达量。根据PBK/TOPK相对表达量的中位数将AML患者分为PBK/TOPK高表达组和低表达组。

1.2.5 治疗与评估 依据患者身体状况和疾病发生情况，对其进行诱导治疗。包括柔红霉素-阿糖胞苷（daunorubicin-cytarabine，DA）、去甲氧柔红霉素-阿糖胞苷（demethoxydaunor-cytarabine,IA)、阿克拉霉素-阿糖胞苷（aclacinomycincytarabine，AA）、高三尖杉酯碱-阿糖胞苷（homoharringtonine-cytarabine，HA）、米托蒽醌-阿糖胞苷（mitoxantrone-cytarabine，MA）、阿糖胞苷和阿克拉霉素联合细胞集落刺激因子（cytosine arabinoside and aclamycin combined with colony stimulating factor，CAG）等传统化疗方案及地西他滨联合减量化疗方案。按照《血液病诊断及疗效标准》[10]判断是否完全缓解（complete remission，CR）：（1）患者未出现由白血病细胞浸润引起的相关临床症状，生活无明显异常；（2）患者外周血中未检测到异常血细胞，Hb≥100 g/L（男）或≥90 g/L（女），中性粒细胞绝对值≥1.0×109/L，PLT计数≥100×109/L；（3）Ⅰ型或Ⅱ型骨髓原始粒细胞≤5%。

1.2.6 随访 采用电话访问、门诊复查、病历查询等方式对AML患者进行定期随访，随访截止时间为2020年2月15日。统计所有患者无进展生存期（event free survival，EFS）和总生存期（overall survival，OS），EFS为自首次CR至复发、死亡或随访截止日期的时长，OS为自确诊至死亡或随访截止日期的时长。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0软件绘图。通过Shaopiro-Wilk法对计量资料进行正态性检验，呈正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；非正态分布计量资料以中位数（M）[四分位数（P25，P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料用例或率表示，组间比较采用χ2检验。当样本例数较少（<40）或理论频数较小（T<5）时，采用Fisher精确性检验。采用Spearman等级检验进行相关性分析采用Kaplan-Meier生存曲线分析不同PBK/TOPK表达水平老年AML患者EFS和OS。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AML患者一般临床资料分析

AML患者初诊时外周血WBC计数为11.16（2.75，50.21）×109/L，Hb为（74.69±20.31）g/L，PLT计数为37.50（19.00，68.00）×109/L，骨髓原始细胞比例为58.24%±23.85%，外周血原始细胞比例为34.00%（7.75%，74.00%）。

FAB分型结果显示，80例老年AML患者中，M2型所占比例最高（35.00%）；细胞遗传学检测结果显示，老年AML患者伴重现性染色体异常41例（51.25%），正常核型39例（48.75%）。19例（23.75%）患者基因检测正常，61例（76.25%）患者检出基因异常，51.25%的AML患者预后不良。见表1。

表1 80例老年AML患者一般临床资料

2.2 2个组骨髓单个核细胞中PBK/TOPK的表达

AML组骨髓样本中均检测到PBK/TOPK表达，相对表达量为3.47±0.74；对照组PBK/TOPK相对表达量为1.43±0.45。AML组PBK/TOPK表达水平显著高于对照组（P<0.05）。见图1。

图1 AML组和对照组骨髓单个核细胞PBK/TOPK的表达

2.3 PBK/TOPK表达与老年AML患者临床特征的关系

有49例AML患者PBK/TOPK高表达，31例低表达。PBK/TOPK相对表达量与患者Hb、PLT计数、染色体核型和基因突变类型有关（P<0.05），与患者年龄、性别、FAB分型、PS评分、WBC计数、骨髓原始细胞比例、外周血原始细胞比例及骨髓增生程度无关（P>0.05）。见表2。

表2 PBK/TOPK表达与老年AML患者临床特征的关系 例

2.4 PBK/TOPK表达与老年AML患者治疗反应的相关性

PBK/TOPK表达与老年AML患者CR率呈负相关（r=-0.743，P<0.05）。PBK/TOPK高表达与低表达AML患者CR率见表3。

表3 不同PBK/TOPK表达水平老年AML患者CR率 例（%）

2.5 PBK/TOPK表达与老年AML患者生存期的关系

80例AML患者随访时间为3.0～36.0个月，中位随访时间为20.0个月，随访完成率为100%。随访结果显示，PBK/TOPK高表达患者1年复发11例，死亡9例；31例PBK/TOPK低表达患者1年复发8例，死亡5例。2个组之间1年复发率和1年生存率差异均无统计学意义（P>0.05）。PBK/TOPK高表达患者3年复发42例（85.7%），死亡30例（61.2%）；PBK/TOPK低表达患者3年复发21例，死亡11例。2个组之间3年复发率和3年生存率差异均有统计学意义（P<0.05）。

PBK/TOPK高表达患者的中位EFS[95%可信区间（confidence interval，CI）（5.9～12.2）]为9个月，明显低于PBK/TOPK低表达患者[14.0（8.8～18.6）个月]（P<0.01）。PBK/TOPK低表达患者中位OS（95%CI）为21.0（16.2～26.4）个月，明显长于PBK/TOPK高表达患者[15.0（15.1～20.9）个月]（P<0.01）。见图2。

图2 PBK/TOPK表达与老年AML患者OS、EFS的关系

3 讨论

AML是常见的成人白血病，美国国家癌症中心统计数据显示，新发AML病例中，≥65岁患者占57.4%[11]，老年人造血系统以粒系造血为主，且基础疾病多，脏器功能代偿能力差，更容易出现不良细胞遗传学改变、骨髓增生异常综合征等不良预后因素，影响诱导化疗的疗效。因此，本研究针对老年AML患者PBK/TOPK表达与治疗反应、生存预后的关系进行初步分析。

本研究结果显示，80例老年AML患者中，M2型（35.00%）发病率最高，以下依次为M4型（26.25%）、M5型（23.75%）、M0型（6.25%）、M1型（3.75%）、M6型（2.50%）和不确定型（2.50%）。细胞遗传学和分子生物学标志物检测对AML诊断、治疗和预后十分重要，老年AML患者较少发生t（8；21）等预后良好的染色体改变，而-5/del（5q）、-7/del（7q）或复杂核型等预后不良核型则较为常见。本研究中，染色体核型异常检出率为51.25%，与国内外报道的AML患者异常核型检出率（46.70%～57.78%）一致[12-13]。有研究结果表明，具有NPM1突变的AML患者预后较好，而存在FLT3-ITD突变的AML患者则预后较差[14]。SCHNEIDER等[15]的研究结果显示，≥60岁AML患者NPMl和FLT3-ITD突变率分别为37.31%和20.68%。而在本研究中，NPMl和FLT3-ITD突变率分别为8.75%、27.50%，提示NPMl和FLT3-ITD突变可能与AML患者地域和种族差异有关。

PBK/TOPK在特定增殖的正常细胞和高度增殖的肿瘤细胞中表达，与细胞增殖分化和肿瘤发生密切相关。近年来的研究发现，PBK/TOPK与白血病、淋巴瘤等血液系统肿瘤的发生密切相关。LIU等[16]和ALACHKAR等[17]均发现PBK/TOPK在AML患者中高表达，SIMONS等[18]发现其在成人Burkitts淋巴瘤中高表达，与本研究AML组PBK/TOPK表达水平显著高于对照组的研究结果一致，提示PBK/TOPK在AML中发挥促癌作用。本研究结果显示，PBK/TOPK低表达的AML患者无FLT3-ITD突变率更低，且染色体核型正常者所占比例更高。原因可能是PBK/TOPK可通过与cdk1/cyclin B结合形成复合物，影响细胞有丝分裂纺锤体的形成，而cdk1/cyclin B主要通过在T9位点的磷酸化来结合PBK/TOPK，上调cyclin B表达，加速细胞G2/M期进程，从而加快肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤的发生。而PBK/TOPK表达在不同Hb和PLT计数人群中的差异性表达可能与AML的进展有关。PBK/TOPK在AML患者预后方面的相关研究较少，一项针对儿童恶性淋巴瘤的研究结果表明，PBK/TOPK阳性表达患儿中位生存时间和5年生存率均显著低于PBK/TOPK阴性表达患儿[19]。本研究结果显示，PBK/TOPK高表达的老年AML患者预后情况较低表达患者差，PBK/TOPK低表达患者CR率高于PBK/TOPK高表达患者，说明PBK/TOPK低表达患者标准化治疗效果更佳。本研究结果显示，治疗1年后不同PBK/TOPK表达患者复发率和生存率差异均无统计学意义（P<0.05），但PBK/TOPK高表达患者3年生存率均较低表达患者低。原因可能是PBK/TOPK高表达可调节多个靶基因，促进AML细胞的增殖和转移，导致患者生存期缩短[20-21]。

综上所述，PBK/TOPK在老年AML患者中表达增加，并且其高表达与患者临床特征相关，可在一定程度上预测老年AML患者的生存预后情况。但本研究样本量较小，患者多来自衢州市相邻地区，关于PBK/TOPK在老年AML患者预后中的作用还需要进一步的研究数据来验证。