甘草次酸的差向异构体对顺铂诱导H9c2心肌细胞损伤的保护机制

马治，王欣爽，刘玥，魏丽萍，齐新△

随着现代医疗技术的进步，癌症患者生存期显著延长，心血管疾病已成为癌症患者最常见的非癌症死亡原因［1］。化疗是抗肿瘤治疗的常用方法之一，但多种化疗药物引起的心脏毒性可增加癌症患者心力衰竭的风险［2］。铂类化疗药物作为广谱抗肿瘤药物应用广泛，近年来其诱发的急慢性脏器毒性备受关注，研究铂类化疗药物心脏毒性发生发展机制，对减轻铂类化疗患者心脏毒性和提出防治策略具有重要意义。中药在改善化疗药物不良反应方面有积极意义。甘草具有良好的抗炎、抗氧化作用，对心脏、肝脏、大脑等多个脏器具有保护作用［3］。甘草酸作为甘草中的有效活性成分，在体内水解为甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）发挥药理作用。研究发现，GA能直接作用于心肌细胞发挥保护作用［4-6］。由于甘草酸18位手性碳原子的构型不同，存在一对差向异构体，即18α-甘草酸和18β-甘草酸，两者经水解后可生成相应18α-甘草次酸（18α-GA）和18β-甘草次酸（18β-GA）［7］。两种构型的甘草次酸亲水性不同，在体内发挥作用效果也存在一定差异［8］。本研究应用18α-GA和18β-GA分别对顺铂（cisplatin，CDDP）作用的H9c2心肌细胞进行干预，探究其缓解CDDP诱导心肌细胞损伤的保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料H9c2心肌细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；CDDP、18β-GA购自MedChem Express公司；18α-GA购自美国sigma公司；胎牛血清购自依科赛生物科技有限公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；0.25%胰酶、CCK-8试剂盒、活性氧（ROS）检测试剂盒购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；Hoechst33258凋亡染色试剂盒、Mito-Tracker Red CMXRos试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗B-淋巴细胞瘤基因-2（Bcl-2）抗体购自Affinity公司；兔抗Bcl-2相关X蛋白（Bax）、细胞色素C（Cyt-c）抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；兔抗剪切化胱天蛋白酶3（C-Caspase3）抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京博奥森生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；CO2培养箱（美国Thermo公司）；荧光倒置显微镜（日本Nikon公司）；Western blot电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 细胞培养及分组

1.2.1 细胞培养H9c2细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱中进行培养。待H9c2心肌细胞生长至80%融合度时，将细胞以1∶3的比例进行传代。根据细胞生长状况，每周换液2~3次。

1.2.2 CDDP毒性浓度筛选分组对照组采用0 μmol/L的CDDP处理，其他组分别使用1、5、10、20、40、60 μmol/L的CDDP孵育24 h。药物干预结束后，弃去旧培养基，加入含有10%CCK-8溶液的DMEM培养基孵育2 h，于酶标仪450 nm波长处检测吸光度。

1.2.3 18α-GA和18β-GA安全浓度筛选分组对照组采用0 μmol/L的18α-GA和18β-GA处理，其他组分别加入3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L的18α-GA和18β-GA孵育24 h。筛选18α-GA和18β-GA的安全浓度，方法同1.2.2。

1.3 CCK-8法检测心肌细胞活力将细胞随机分为对照组（正常培养细胞）、CDDP组（加入20 μmol/L CDDP）、18α-GA低剂量组（加入20 μmol/L CDDP和3.125 μmol/L 18α-GA）、18α-GA中剂量组（加入20 μmol/L CDDP和50 μmol/L 18α-GA）、18α-GA高剂量组（加入20 μmol/L CDDP和100 μmol/L 18α-GA）、18β-GA低剂量组（加入20 μmol/L CDDP和3.125 μmol/L 18β-GA）、18β-GA中剂量组（加入20 μmol/L CDDP和50 μmol/L 18β-GA）、18β-GA高剂量组（加入20 μmol/L CDDP和100 μmol/L 18β-GA），分别干预细胞24 h后进行CCK-8实验，选定18α-GA和18β-GA浓度进行后续实验。

1.4 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡将细胞随机分为对照组（正常培养细胞）、CDDP组（加入20 μmol/L CDDP）、18α-GA组（加入20 μmol/L CDDP和100 μmol/L 18α-GA）、18β-GA组（加入20 μmol/L CDDP和100 μmol/L 18β-GA）。将细胞接种于六孔板内，加入药物干预24 h后，使用PBS溶液洗涤3遍，加入0.5 mL固定液，固定20 min，用PBS将固定液清洗干净。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，摇床染色5 min，PBS洗净染色液。使用荧光显微镜检测细胞凋亡情况。

1.5 流式细胞术检测ROS含量各组药物干预24 h后吸弃含有药物培养基，离心收集细胞，使用预冷的PBS清洗细胞。按照1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μmol/L。加入适当稀释好的探针，用无血清细胞培养液洗涤细胞1~2次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。于流式细胞仪上检测细胞荧光强度。使用FlowJoVX分析实验结果。

1.6 Mito-Tracker Red CMXRos染色检测线粒体活性 各组进行药物干预后，弃去细胞培养板中原有的培养液，加入配制好的Mito-Tracker Red CMXRos工作液，37℃孵育20 min。弃掉Mito-Tracker Red CMXRos工作液，加入37℃预温的新鲜细胞培养液，于荧光显微镜下观察荧光强度。采用Image J的MINA分析线粒体网络形态。

1.7 Western blot检测各组细胞中C-Caspase3、Bcl-2、Bax、Cyt-c蛋白表达水平 各组加入含有PMSF的RIPA裂解液，提取蛋白，BCA法测蛋白浓度。10%SDS-PAGE电泳分离蛋白，PVDF转膜；5%脱脂牛奶室温摇床封闭2 h。抗体孵育：封闭结束，将一抗Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶2 000）、CCaspase3（1∶1 000）、Cyt-c（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）分别按比例进行稀释，4℃摇床过夜。取出一抗，TBST摇床洗膜3次。加入二抗（1∶10 000）室温摇床孵育2 h，TBST摇床洗膜3次。避光条件下采用化学发光法进行显色。采用Image J软件进行蛋白定量分析。

1.8 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料采用±s表示。符合方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Tukeyʹs检验；不符合方差齐性检验，多组间比较采用Welch检验，多重比较采用Dunnettʹs T3检验。不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，多重比较采用Tukeyʹs检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 18 α-GA及18β-GA对CDDP诱导的心肌细胞活力的影响CCK-8结果提示，CDDP呈剂量依赖性引起心肌细胞活力降低，与0 μmol/L相比，20 μmol/L的CDDP显著降低心肌细胞活力（P＜0.01），且细胞活力在50%左右，见图1。与0 μmol/L相比，3.125、6.25、12.5、25、50及100 μmol/L的18α-GA和18β-GA对H9c2心肌细胞活力差异无统计学意义，见图2。与CDDP组相比，18α-GA和18β-GA低剂量组细胞活力差异无统计学意义，18α-GA、18β-GA中剂量组和高剂量组均可改善CDDP导致的心肌细胞活力的降低（P＜0.01），见图3。本研究采用20 μmol/L的CDDP、100 μmol/L的18α-GA和18β-GA进行后续实验。

Fig.1 Effects of CDDP on viability of H9c2 cardiomyocytes图1 CDDP对H9c2心肌细胞活力的影响

Fig.2 Effects of 18α-GA and 18β-GA on the viability of H9c2 cells图2 18α-GA和18β-GA对H9c2心肌细胞活力的影响

Fig.3 Effects of low,medium and high doses of 18α-GA and 18β-GA on cisplatin-induced myocardial cell viability图3 18α-GA及18β-GA低、中、高剂量对CDDP诱导心肌细胞活力的影响

2.2 18 α-GA及18β-GA对CDDP诱导的心肌细胞凋亡情况影响与对照组相比，CDDP组细胞凋亡明显，细胞数量减少，细胞核呈致密浓染且碎片状，蓝色荧光着色深；与CDDP组相比，18α-GA组和18β-GA组细胞形态规则、数量增多，且细胞核基本呈弥散、均匀的蓝色荧光。见图4。

2.3 18 α-GA及18β-GA对CDDP诱导的心肌细胞ROS含量的影响对照组、CDDP组、18α-GA组和18β-GA组相对ROS含量分别为1.00±0.05、5.81±0.40、0.69±0.07和0.62±0.08，组间差异有统计学意义（n=4，F=196.432，P＜0.01）。与对照组相比，CDDP组ROS含量增加（P＜0.01）；与CDDP组相比，18α-GA组和18β-GA组细胞内ROS含量降低（P＜0.01）。见图5。

2.4 18 α-GA及18β-GA对顺铂诱导的心肌细胞线粒体活性的影响与对照组相比，CDDP组心肌细胞内线粒体足长度和具有网状结构的线粒体数量明显降低（P＜0.05）；与CDDP组相比，18α-GA组和18β-GA组线粒体足长度和具有网状结构的线粒体数量明显增加（P＜0.05），见图6、表1。

Fig.4 Effects of 18α-GA and 18β-GA on CDDP-induced apoptosis of cardiomyocytes(Hoechst staining,×400)图4 18α-GA及18β-GA对CDDP诱导的心肌细胞凋亡的影响（Hoechst染色，×400）

Fig.5 Effects of 18α-GA and 18β-GA on ROS content in cardiomyocytes induced by cisplatin图5 18α-GA和18β-GA对顺铂诱导心肌细胞ROS含量的影响

Fig.6 Effects of 18α-GA and 18β-GA on mitochondrial activity of cardiomyocytes induced by CDDP(×400)图6 18α-GA和18β-GA对CDDP诱导心肌细胞线粒体活性的影响（×400）

Tab.1 Comparison of mitochondrial foot length and number of mitochondria with reticular structure between the four groups表1各组细胞线粒体足长度和具有网状结构的线粒体数量比较 （n=6）

2.5 18 α-GA及18β-GA对顺铂诱导的线粒体相关凋亡蛋白表达的影响与对照组相比，CDDP组CCaspase3、Cyt-c蛋白表达水平升高，Bcl-2/Bax蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与CDDP组相比，18α-GA组和18β-GA组的C-Caspase3和Cyt-c蛋白表达水平降低，Bcl-2/Bax蛋白表达水平升高（P＜0.05）。见表2、图7。

Tab.2 Comparison of protein expression levels of CCaspase3,Bcl-2/Bax and Cyt-c between the four groups表2各组C-Caspase3、Bcl-2/Bax、Cyt-c的蛋白表达水平比较 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of protein expression levels of CCaspase3,Bcl-2/Bax and Cyt-c between the four groups表2各组C-Caspase3、Bcl-2/Bax、Cyt-c的蛋白表达水平比较 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组相比，b与CDDP组相比，P＜0.05。

组别对照组CDDP组18α-GA组18β-GA组F C-Caspase3 1.06±0.40 2.15±0.40a 1.30±0.28b 1.30±0.35b 10.321＊＊Bcl-2/Bax 1.00±0.15 0.50±0.04a 0.97±0.18b 0.88±0.09b 9.768＊＊Cyt-c 0.97±0.41 2.66±0.22a 1.11±0.25b 0.57±0.04b 36.039＊＊

3 讨论

肿瘤心脏病学作为一门新生交叉学科，在过去十年中取得了重大进展并形成国际专家共识［9］。国际指南对放化疗及靶向药物的心血管毒性及防治提供了临床指导。抗肿瘤药物产生的心脏毒性反应是肿瘤心脏病学的主要研究内容之一，如放化疗引起的心功能改变、化疗后心肌损伤导致生物标志物的变化以及心律改变等［10］。铂类化疗药在对抗实体瘤方面具有良好的效果，然而随着使用时间与剂量的增加，机体可出现不同程度的心脏毒性反应。本研究发现，CDDP干预H9c2心肌细胞可使心肌细胞活力呈剂量依赖性下降。20 μmol/L的CDDP可致心肌细胞活力下降至50%左右，且细胞发生凋亡。

Fig.7 Effects of 18α-GA and 18β-GA on CDDP-induced mitochondrial-related apoptostic protein expression in cardiomyocytes图7 18α-GA和18β-GA对CDDP诱导的心肌细胞线粒体相关凋亡蛋白表达的影响

多种中药提取物应用于临床可起到多通路多靶点的心脏保护作用。研究发现，GA能够减少心肌梗死面积、改善室性心律失常，并可保护心肌细胞免受缺氧缺糖诱导的损伤［11］。然而，GA能否对CDDP诱导的心肌细胞损伤发挥保护作用尚不明确。本研究结果显示，＜100 μmol/L的18α-GA和18β-GA对心肌细胞活力无明显影响，进一步研究发现，50 μmol/L和100 μmol/L的18α-GA及18β-GA均可提升CDDP造成的心肌细胞活力的下降，且在100μmol/L时效果较好。Hoechst 33258凋亡染色结果提示，100 μmol/L的18α-GA和18β-GA均可有效抑制CDDP诱导的心肌细胞凋亡。

铂类化疗药物产生的脏器毒性反应一般是多重因素共同作用所致，如DNA损伤、氧化应激、炎症反应以及细胞相关凋亡通路的发生等。多项研究表明氧化应激在顺铂诱导心脏毒性中发挥重要作用［12-14］。在CDDP诱导的细胞毒性中，ROS生成的增加是重要因素［15］。少量的ROS可对细胞发挥有益作用，然而大量的ROS过度堆积将对细胞产生有害的影响，特别是激活细胞凋亡通路。ROS过度积累可改变线粒体膜电位并破坏呼吸链，最终触发凋亡。同时，线粒体是ROS的主要产出场所，线粒体损伤也可导致ROS的不断产生，形成恶性循环。抑制ROS的产生可有效缓解CDDP导致的心肌损伤。研究发现GA可通过抑制ROS与细胞凋亡对心肌细胞发挥一定的保护作用［16-17］。本研究结果显示，在CDDP作用下的H9c2心肌细胞内ROS水平较对照组明显增加，在给予18α-GA和18β-GA处理24 h后可显著降低CDDP诱导的心肌细胞ROS的产生。

研究发现，CDDP给药后可在线粒体内快速蓄积，使线粒体结构和功能发生改变，最终导致细胞凋亡［18］。线粒体介导的内源性凋亡是参与CDDP诱导细胞凋亡的主要形式［19］。当细胞发生凋亡时，包括ROS在内的应激信号将调控线粒体膜通透性，此时线粒体外膜上的Bcl-2的表达降低，使得线粒体膜通透性增高，存在于胞浆内的Bax可被转移到线粒体，结合在线粒体外膜形成线粒体凋亡通道，导致Cyt-c释放，激活Caspase级联反应［20］。为探究18α-GA和18β-GA能否改善CDDP引发的线粒体功能障碍，笔者对线粒体相关指标进行检测。结果显示，与对照组相比，CDDP组细胞具有网状结构的线粒体数量和线粒体足长度明显降低，说明具有生物活性的线粒体减少，线粒体碎片增多，同时线粒体相关蛋白Bcl-2/Bax的表达降低，引起线粒体膜通透性的增高，导致Cyt-c的外泄，引起Caspase3激活；经过18α-GA和18β-GA干预后线粒体网络结构明显增加，线粒体碎片的产生减少，Bcl-2/Bax的表达升高，线粒体生物活性提高，抑制Cyt-c的外排以及Caspase3的表达。以上结果表明18α-GA和18β-GA可以改善线粒体功能，对CDDP诱导的心肌细胞损伤发挥保护作用。

综上，18α-GA和18β-GA可抑制ROS的生成并改善心肌细胞线粒体功能障碍，减轻CDDP对H9c2心肌细胞的损伤作用。GA在体的心肌保护作用需要进一步的实验研究。