芦丁对慢性脑低灌注大鼠海马组织神经元损伤及RhoA/ROCK信号通路的影响

李艳，刘琼，黄萱，刘丽江△

慢性脑低灌注由颈动脉狭窄、闭塞，动脉硬化等多种因素引起，表现为脑部的供血不足和血流降低，是造成血管性痴呆、阿尔茨海默病、认知障碍等神经系统疾病的主要原因［1-2］。海马是机体学习记忆的关键部位，主要负责储存信息，具有独特的血管组成和分布，脑部缺血损伤常导致海马组织神经元结构和功能异常，过度凋亡等，从而诱发认知障碍［3-4］。芦丁是一种来源较广的黄酮类化合物，具有神经保护、血管保护、细胞保护、抗氧化、抗癌等多种生理活性［5］。Javed等［6］研究发现，芦丁可明显提高链脲佐菌素诱导的阿尔茨海默病大鼠的认知能力，并对海马组织具有一定的保护作用。但关于芦丁的神经保护作用机制及其对慢性脑低灌注大鼠海马组织神经元影响的报道较少。Ras同源基因家族成员A（Ras homolog gene family member A，RhoA）是Rho GTP酶家族成员，与细胞发育、细胞骨架调控等多种细胞生物学活动联系密切，Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil protein kinase，ROCK）是RhoA重要的下游效应分子。Li等［7］研究结果显示，抑制RhoA/ROCK通路可明显改善糖尿病所致脑组织微血管病变、CA1区神经元损伤及认知障碍。本研究以RhoA/ROCK通路为切入点，探究芦丁对慢性脑低灌注大鼠的海马组织神经元及认知功能的影响及其可能机制，为临床缓解慢性脑低灌注提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性SPF级SD大鼠54只，10周龄，体质量260~280 g，购自江汉大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（鄂）2019-0017。大鼠自由饮食、饮水，自然光照，动物房温度保持在25℃左右，相对湿度保持在50%左右，保持动物房清洁，按时对鼠笼进行清洁。本研究经江汉大学动物伦理委员会批准同意。

1.2 主要药物、试剂及仪器芦丁（货号B20771，原料药，纯度≥99%）购自上海源叶生物科技有限公司；RhoA抑制剂Rhosin hydrochloride（货号1281870-42-5）购自美国Glpbio公司；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（货号G1121）、蛋白提取试剂盒（货号BC3711）、DAB显色试剂盒（货号DA1015）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号PC0020）均购自北京索莱宝科技有限公司；原位缺口末端标记（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（货号11684817910）购自瑞士Roche公司；兔源胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（Bax）、RhoA、ROCK1、ROCK2、GAPDH一抗及羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司（货 号依次为ab184787、ab32503、ab187027、ab125025、ab134181、ab9485、ab6721）；生物组织脱水机（型号DB-680C）购自孝感市德比电子科技有限公司；光学显微镜（型号DMD108）购自德国徕卡公司；透射电镜（型号Talos）购自美国FEI公司；凝胶成像仪（型号Gelstudio touch）购自德国耶拿公司。

1.3 研究方法

1.3.1 动物模型制备及分组给药慢性脑低灌注大鼠模型的构建参照文献［8］，54只SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组（9只）和造模组（45只）。造模组所有大鼠均于术前12 h禁食，术前4 h禁水，将大鼠麻醉后以仰卧位固定，颈部备皮并消毒后于正中做约1 cm的纵向切口，暴露颈动脉，分离双侧颈动脉及迷走神经，采用4号手术线结扎左侧总颈动脉的近心端及远心端，离断血管，逐层缝合切口，1周后结扎右侧总颈动脉并离断血管，假手术组仅进行颈动脉分离，不进行结扎，1周后动物存活即为模型构建成功。造模过程中若出现大鼠死亡，及时选取备用大鼠进行造模处理，成功造模45只大鼠。假手术组未出现大鼠死亡。

将模型构建成功的大鼠按照随机数字表法分为模型组、芦丁低剂量组（20 mg/kg）、芦丁中剂量组（40 mg/kg）、芦丁高剂量组（80 mg/kg）［9］、RhoA抑制剂组（Rhosin hydrochloride，40 mg/kg）［10］，每组9只。芦丁用二甲基亚砜溶解并用生理盐水稀释配制成2、4、8 g/L的溶液，以10 mL/kg的体积灌胃，芦丁低、中、高剂量组大鼠分别按照20、40、80 mg/kg的剂量进行灌胃处理；RhoA抑制剂组大鼠腹腔注射40 mg/kg的Rhosin hydrochloride；假手术组及模型组大鼠灌胃等量生理盐水稀释的二甲基亚砜；每天给药1次，持续4周。

1.3.2 大鼠认知功能和记忆能力测定采用Morris水迷宫实验测定各组大鼠的认知功能和记忆能力［11］，包括定位巡航实验和空间探索实验。定位巡航实验：将水温为25℃左右的水池等分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限，将平台置于第Ⅰ象限中央并低于水面2 cm，将大鼠在每天上下午从Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限区域放入水中，记录其寻找并爬上平台的时间为逃避潜伏期，该值越高表明认知功能越差，若大鼠在90 s内仍未找到平台，则引导其找到平台，并记为90 s。每天训练4次，潜伏期取4次的平均值，训练持续4 d。空间探索实验：第5天撤去平台，记录120 s内大鼠穿越平台次数，次数越少表明记忆能力越差。

1.3.3 大鼠海马组织标本采集Morris水迷宫实验结束后，按随机数字表法抽取3只大鼠麻醉后进行生理盐水及多聚甲醛-戊二醛灌注，待其四肢变硬后取海马CA1区组织，用于海马组织神经元超微结构观察；将剩余大鼠麻醉后处死，剪开大鼠头顶部皮肤并依次切开肌肉、骨膜，暴露并分离颅骨，使脑组织充分暴露，用手术刀分离大鼠海马CA1区组织，3只用于HE染色及TUNEL检测，3只用于凋亡相关蛋白及RhoA/ROCK通路相关蛋白测定。

1.3.4 大鼠海马组织HE染色观察取1.3.3中海马组织，置于4%多聚甲醛中固定48 h后采用生物组织脱水机进行组织脱水、透明及浸蜡处理，待浸蜡的组织块凝固后切成4 μm的切片，贴附在载玻片上，采用HE染色试剂盒进行脱蜡、水化、苏木素染色、分化液处理、返蓝液返蓝、伊红染色、脱水、透明，风干后封片于显微镜下观察并拍照分析。

1.3.5 大鼠海马组织神经元凋亡测定将1.3.4中切片用二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、多聚甲醛固定、PBS冲洗后加入蛋白酶K进行细胞通透处理，PBS洗涤后放入湿盒中平衡约10 min，加入TUNEL反应液，黑暗环境中反应1 h，PBS洗涤后加入转化剂，继续反应30 min，PBS洗涤后加入DAB显色液，显微镜下观察到浅棕色背景后用去离子水冲洗4次，用苏木素复染3 s后用自来水冲洗，经过脱水、透明处理后进行封片，显微镜下观察并拍照分析。神经元凋亡率（%）=棕褐色细胞（阳性细胞）/视野总细胞×100%

1.3.6 大鼠海马组织神经元超微结构观察取1.3.3中大鼠海马组织，于2.5%戊二醛溶液中固定24 h，用PBS冲洗后于1%锇酸溶液中固定1 h，经过梯度乙醇-丙酮脱水、环氧树脂包埋、超薄切片、醋酸铀和柠檬酸铅染色后于透射电镜下观察并拍照分析。

1.3.7 大鼠海马组织凋亡相关蛋白及RhoA/ROCK通路蛋白表达检测 取1.3.3中海马组织，用剪刀剪碎后采用蛋白质提取试剂盒提取总蛋白质，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其中蛋白质浓度，将各组待测蛋白样品沸水浴10 min，变性完全后进行电泳实验分离蛋白（5%浓缩胶、12%分离胶），采用湿转法将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉封闭2 h，根据分子质量截取蛋白条带，加入兔源Caspase-3（1∶100）、Bax（1∶100）、RhoA（1∶200）、ROCK1（1∶100）、ROCK2（1∶100）、GAPDH（1∶200）一抗，4℃冰箱孵育过夜，洗去多余一抗后加入羊抗兔二抗，室温孵育2 h，显色曝光后凝胶成像仪中观察并分析条带灰度值。以GAPDH为内参计算目的蛋白的相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行实验数据统计及分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芦丁对大鼠认知功能和记忆能力的影响与假手术组相比，模型组大鼠逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少（均P＜0.05）；与模型组相比，芦丁各剂量组及RhoA抑制剂组大鼠逃避潜伏期缩短，穿越平台次数显著增多（均P＜0.05），且芦丁各剂量组呈剂量依赖效应；芦丁高剂量组与RhoA抑制剂组的逃避潜伏期和穿越平台次数比较，差异无统计学意义，见表1。

2.2 芦丁对大鼠海马组织神经元结构的影响假手术组海马CA1区组织神经元排列整齐，染色清晰，未出现坏死情况；与假手术组相比，模型组神经元数量减少，排列疏松且紊乱，出现细胞核固缩等神经病理性改变；与模型组相比，芦丁各剂量组及RhoA抑制剂组神经元数量显著增多，排列较为整齐，细胞核固缩等现象得到缓解；芦丁高剂量组与RhoA抑制剂组神经元结构类似。见图1。

Tab.1 Comparison of incubation period and number of swimming across the platform of rats between the six groups表1各组大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数比较 （n=9，±s）

Tab.1 Comparison of incubation period and number of swimming across the platform of rats between the six groups表1各组大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数比较 （n=9，±s）

＊＊P＜0.01；a与假手术组相比，b与模型组相比，c与芦丁低剂量组相比，d与芦丁中剂量组相比，P＜0.05；表2、3同。

组别假手术组模型组芦丁低剂量组芦丁中剂量组芦丁高剂量组RhoA抑制剂组F逃避潜伏期（s）第1天37.10±7.38 85.06±10.75a 72.55±9.02ab 62.83±8.74abc 45.44±9.17abcd 47.08±8.99abcd 36.835＊＊第2天36.12±6.59 83.94±10.52a 71.83±9.87ab 61.06±9.33abc 44.26±8.94abcd 46.52±7.99abcd 37.389＊＊第3天35.28±7.03 82.31±10.58a 70.50±9.68ab 59.22±8.36abc 43.81±8.07abcd 45.60±9.70abcd 35.664＊＊第4天34.15±7.11 81.85±11.94a 69.33±10.52ab 57.60±10.58abc 42.40±9.00abcd 44.28±8.94abcd 30.731＊＊穿越平台次数（次）17.62±3.67 4.96±1.03a 6.53±1.35ab 9.18±2.15abc 13.12±2.65abcd 14.61±3.10abcd 34.785＊＊

2.3 芦丁对大鼠海马组织神经元凋亡的影响与假手术组相比，模型组海马组织神经元凋亡率、凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax表达显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，芦丁各剂量组及RhoA抑制剂组大鼠海马组织神经元凋亡率、Caspase-3、Bax表达显著降低（P＜0.05），且芦丁各剂量组呈剂量依赖效应，芦丁高剂量组与RhoA抑制剂组大鼠海马组织神经元凋亡率、Caspase-3、Bax表达比较差异无统计学意义。见表2，图2、3。

Tab.2 Comparison of neuronal apoptosis rate and expression levels of apoptosis-related proteins Caspase-3 and Bax in hippocampal neurons of rats between the six groups表2各组大鼠海马组织神经元凋亡率和凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax表达比较 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of neuronal apoptosis rate and expression levels of apoptosis-related proteins Caspase-3 and Bax in hippocampal neurons of rats between the six groups表2各组大鼠海马组织神经元凋亡率和凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax表达比较 （n=3，±s）

组别假手术组模型组芦丁低剂量组芦丁中剂量组芦丁高剂量组RhoA抑制剂组F凋亡率（%）2.84±0.59 30.25±5.31a 19.13±3.96ab 11.26±2.73abc 6.29±1.33abcd 5.87±1.24abcd 35.114＊＊凋亡相关蛋白Caspase-3 0.21±0.04 1.26±0.18a 0.90±0.13ab 0.61±0.10abc 0.41±0.06abcd 0.39±0.07abcd 39.040＊＊Bax 0.23±0.05 1.30±0.15a 0.97±0.14ab 0.66±0.12abc 0.40±0.10abcd 0.43±0.10abcd 36.955＊＊

Fig.2 Apoptosis of hippocampal neurons of rats in each group(TUNEL staining,×400)图2各组大鼠海马组织神经元凋亡情况（TUNEL染色，×400）

Fig.3 Expression levels of apoptosis-related proteins(Caspase-3 and Bax)in hippocampal neurons of rats in each group图3各组大鼠海马组织神经元凋亡相关蛋白（Caspase-3、Bax）表达情况

2.4 芦丁对大鼠海马组织神经元超微结构的影响假手术组海马组织神经元超微结构、细胞器结构基本正常；模型组海马组织神经元超微结构、细胞器结构受损严重，细胞器数量减少，线粒体肿胀、畸形，甚至溶解消失。与模型组相比，芦丁各剂量组及RhoA抑制剂组大鼠海马组织神经元超微结构、细胞器受损等均得到一定的恢复，且芦丁各剂量组呈现一定的剂量依赖效应；芦丁高剂量组与RhoA抑制剂组表现类似。见图4。

2.5 芦丁对大鼠海马组织RhoA/ROCK通路蛋白表达的影响与假手术组相比，模型组海马组织RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组相比，芦丁各剂量组及RhoA抑制剂组海马组织RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达显著降低（P＜0.05），且芦丁各剂量组呈剂量依赖效应。芦丁高剂量组与RhoA抑制剂组海马组织RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达比较差异无统计学意义。见表3、图5。

Fig.4 Ultrastructural observation of hippocampal neurons of rats in each group(stained with Uranium acetate and lead citrate,×30 000)图4各组大鼠海马组织神经元超微结构观察（醋酸铀和柠檬酸铅染色，×30 000）

Tab.3 Comparison of RhoA,ROCK1 and ROCK2 protein expressions in hippocampus of rats between the six groups表3各组大鼠海马组织RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达比较 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of RhoA,ROCK1 and ROCK2 protein expressions in hippocampus of rats between the six groups表3各组大鼠海马组织RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达比较 （n=3，±s）

组别假手术组模型组芦丁低剂量组芦丁中剂量组芦丁高剂量组RhoA抑制剂组F RhoA 0.11±0.03 1.08±0.12a 0.79±0.11ab 0.53±0.09abc 0.32±0.06abcd 0.30±0.05abcd 55.651＊＊ROCK1 0.21±0.05 1.28±0.14a 0.99±0.12ab 0.71±0.09abc 0.41±0.07abcd 0.43±0.07abcd 53.794＊＊ROCK2 0.17±0.03 1.34±0.20a 0.95±0.15ab 0.63±0.11abc 0.33±0.06abcd 0.36±0.07abcd 42.043＊＊

3 讨论

Fig.5 Expression levels of RhoA,ROCK1 and ROCK2 proteins in hippocampus of rats in each group图5各组大鼠海马组织RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达情况

慢性脑低灌注是老年人认知功能障碍的主要危险因素，脑组织长期处于低灌注状态会引起脑内大量神经元功能受损，进而引起患者神经变性及学习记忆障碍。既往研究常通过永久性结扎颈动脉构建慢性脑低灌注大鼠模型，可观察到模型大鼠学习记忆能力降低、神经元凋亡及结构改变等［12-13］。本研究通过结扎大鼠双侧颈动脉构建慢性脑低灌注大鼠模型，结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数明显减少，HE染色结果显示模型组大鼠海马组织神经元排列疏松且紊乱，出现细胞核固缩等神经病理性改变，神经元凋亡率和凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax表达升高；电镜结果显示细胞器结构受损严重，细胞器数量减少，线粒体肿胀、畸形，甚至溶解消失，提示慢性脑低灌注可引起大鼠认知功能障碍及海马组织神经元损伤，表明慢性脑低灌注大鼠模型构建成功。

海马区、脑部额叶皮层中的大量神经元在维持认知、记忆功能等方面发挥重要作用，脑血流灌注不足使脑组织处于低氧低灌注状态，会引起脑组织中大量神经元受损，进而引起进展性或持久性认知障碍［14］。芦丁是存在于多种植物中的天然黄酮类化合物，具有清除自由基、抗炎、调节免疫、神经保护等多种生理药理活性［15］。Kumar等［16］研究显示芦丁可减轻脑外伤所致大鼠脑皮层及海马区神经元损伤及凋亡情况，并改善大鼠认知功能障碍。石茜等［17］研究结果显示，芦丁可提高D-半乳糖所致衰老小鼠的记忆及认知功能，减少海马组织神经元凋亡数目，从而发挥其神经保护功能。本研究结果显示，与模型组相比，经过芦丁治疗的慢性脑低灌注大鼠逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加，海马组织神经元损伤得到缓解，神经元凋亡率和凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax表达降低，神经元中细胞器受损情况得到缓解，且呈现一定的剂量效应关系，其中芦丁高剂量组效果较好，表明芦丁可改善慢性脑低灌注引起的认知功能障碍及神经元损伤，但关于其作用机制仍不清晰。

RhoA/ROCK通路具有调控细胞增殖、分化、凋亡等作用，RhoA是Rho GTP酶家族的主要成员，ROCK1、ROCK2为RhoA的下游效应分子，RhoA/ROCK通路的激活可导致成纤维细胞肌动蛋白应力纤维的形成，导致轴突回缩及生长锥的塌陷，进而抑制神经再生［18-19］。陆跃等［20］研究结果显示抑制该通路的激活可促进脑缺血后神经功能的恢复。激活RhoA/ROCK通路可导致血管狭窄，从而降低脑组织血流，加剧神经元凋亡［21］。单海雷等［22］研究结果显示抑制RhoA/ROCK通路可减轻脑缺血再灌注导致的神经元凋亡和氧化应激，从而缓解大鼠神经功能障碍。本研究结果显示，模型组大鼠海马组织RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达显著高于假手术组，提示RhoA/ROCK通路的激活可能参与了神经元损伤过程；与模型组相比，芦丁各剂量组大鼠海马组织RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达显著降低，且芦丁高剂量组效果与RhoA抑制剂效果相似，表明芦丁可能通过抑制RhoA/ROCK通路发挥神经元保护作用。

综上所述，芦丁对慢性脑低灌注引起的大鼠海马组织损伤具有一定的保护作用，且可能是通过抑制RhoA/ROCK通路发挥作用。但芦丁作用机制复杂，本研究仅采用通路抑制剂进行对比观察，未设置相应通路激活剂，有待深入研究。