唑来膦酸盐通过p38 MAPK信号通路调控高糖微环境下成骨细胞分化

侯甜，秦雅芝，张妍，温国琛，张啸，董伟

糖尿病性骨质疏松症（diabetic osteoporosis，DOP）发病机制涉及糖基化终末产物增加及成骨细胞活性降低等［1］。高葡萄糖环境对成骨细胞增殖和分化的抑制作用可能是多种机制相互作用的结果［2］。唑来膦酸盐（zoledronate，ZOL）是临床使用中最有效和最长效的双膦酸盐（biphosphonates，BPs）类药物之一，可治疗原发性或继发性骨质疏松症［3］。然而，目前关于ZOL在高糖微环境下对成骨细胞分化的确切作用机制还需进一步明确。研究显示，ZOL能促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的骨钙素表达，调节成骨细胞的分化［4］。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated kinase，p38 MAPK）信号途径是参与成骨细胞分化的关键途径之一，可调节复杂的细胞程序［5］。在骨骼生成过程中，Wnt信号通路在各类细胞的成骨机制中同样发挥着关键作用［6］。本研究旨在探讨高糖微环境下ZOL在MC3T3-E1细胞分化过程中的影响及p38 MAPK通路的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料细胞MC3T3-E1购于中国科学院上海细胞生物所。p38 MAPK通路抑制剂SB203580购于Selleck公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、鬼笔环肽、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液均购于Sigma-Aldrich公司；胎牛血清（FBS）、DMEM培养基购于BI公司；BCA试剂盒、胰酶、碘化丙啶（PI）染色液、二甲基亚砜（DMSO）均购于Beyotime公司；碱性磷酸酶（ALP）试剂盒购于南京建成生物工程研究所；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购于北京索莱宝科技有限公司；茜素红染色液购于北京雷根生物技术有限公司；兔抗小鼠p38 MAPK一抗、p-p38 MAPK一抗购于Cell Signaling公司；兔抗小鼠Wnt5a一抗购于SCBT公司；兔抗小鼠骨形态发生蛋白2（BMP2）一抗购于GeneTex公司；兔抗小鼠Ⅰ型胶原蛋白（COLⅠ）一抗购于Affinity公司；兔抗小鼠GAPDH、异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的山羊抗鼠二抗、四甲基罗丹明异硫氰酸盐（TRITC）偶联的山羊抗兔二抗均购于Proteintech公司；羊抗兔二抗购于KPL公司。CO2培养箱购于上海博讯实业有限公司，荧光显微镜购于OLYMPUS公司，超净工作台购于青岛海尔公司，全自动酶标仪购于上海永创医疗器械有限公司。

1.2研究方法

1.2.1 细胞培养及分组将冻存的MC3T3-E1细胞在37℃水浴箱中复苏，复苏后的细胞培养在含10%FBS、1%双抗的DMEM培养基中，隔天换液，当密度达80%~90%时，用胰酶消化，传代培养。依处理方法的不同，将MC3T3-E1细胞分为低糖（LG）组、LG+ZOL组、高糖（HG）组、HG+ZOL组。在Western blot实 验 中 加 入 第5组：HG+ZOL+SB203580组。SB203580浓度为10 μmol/L，LG、HG分别为5.5 mmol/L和16.5 mmol/L的葡萄糖，ZOL为0.1 μmol/L。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖能力将MC3T3-E1细胞消化完成后调整密度为4 000个/孔，将细胞悬液移至96孔板，每孔滴加100 μL细胞悬液。待细胞完全贴壁伸展后弃掉原培养基，按1.2.1实验分组对MC3T3-E1细胞进行处理。培养至24、48、72 h时，吸去上清液，PBS洗涤2遍，加入MTT（5 g/L）20 μL/孔，在37℃条件下继续培养4 h，吸去上清液，分别加入DMSO 150 μL/孔，震荡15 min，使蓝紫色结晶溶解。使用酶标仪在490 nm波长处测定细胞的吸光度（A）值。

1.2.3 细胞骨架荧光染色在6孔板中提前放置好细胞爬片，取生长状态良好的MC3T3-E1细胞，将其消化为细胞悬液，细胞以2×104个/孔的密度接种在6孔板中，每孔滴加细胞悬液为1 mL。待细胞完全贴壁伸展后按1.2.1分组对MC3T3-E1细胞进行处理。24 h后弃去孔板内液体，PBS洗2遍，用4%多聚甲醛固定细胞，0.5%Triton X-100透化10 min，PBS再次洗涤，向孔板内加入200 μL浓度为100 nmol/L的鬼笔环肽染液，覆盖细胞爬片，避光孵育3 h，随后用PI染液复染核5 min。荧光显微镜下采集照片并观察细胞骨架，用Image J软件分析细胞数目。

1.2.4 ALP活性定量检测将MC3T3-E1细胞消化完成后收集细胞悬液，以1×104个/孔的细胞密度转移至24孔板，每孔滴入500 μL细胞悬液。待细胞完全贴壁伸展后，按1.2.1分组处理，同时各组添加成骨诱导液连续诱导7 d，隔天换液。检测过程按试剂盒说明书中的操作步骤进行，于520 nm波长处检测孔板内细胞的A值，根据说明书计算ALP活性。

1.2.5 茜素红染色检测矿化结节生成情况将MC3T3-E1细胞消化完成后按1×104个/孔的接种密度将细胞悬液转移至24孔板，每孔滴入500 μL细胞悬液。待细胞完全贴壁伸展后，按1.2.1分组处理，各组添加成骨诱导液连续诱导21 d，隔天换液，95%乙醇固定细胞30 min，茜素红染液对结节染色5 min。Image J软件分析茜素红染色阳性区域占总区域的百分比表示矿化结节生成情况。

1.2.6 免疫荧光法检测MC3T3-E1细胞的Wnt5a、p38 MAPK表达在6孔板内放置好细胞爬片，将MC3T3-E1细胞消化完成后，以4×104个/孔的密度接种，向6孔板中的爬片上滴加1 mL细胞悬液。待细胞完全贴壁伸展后按1.2.1分组更换培养基。24 h后弃去培养基，爬片上滴加4%多聚甲醛后固定30 min，10%山羊血清封闭30 min，弃液后向孔板内各组爬片滴加抗体Wnt5a（1∶50）、p38 MAPK（1∶50），4℃孵育过夜。第2天向孔内爬片加入FITC、TRITC标记的二抗，37℃条件下孵育2 h，DAPI染核2 min。荧光显微镜下观察各组Wnt5a、p38 MAPK的表达，Image J软件分析各组细胞的平均荧光表达强度。

1.2.7 Western blot检测Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表达MC3T3-E1细胞悬液移至6孔板中。按1.2.1分组更换培养基并添加成骨诱导液连续诱导7 d，隔天换液。用预冷的PBS冲洗后，裂解液提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒测蛋白浓度，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转到PVDF膜上，封闭液封闭2 h，加入一抗Wnt5a（1∶1 000）、p38 MAPK（1∶1 000）、p-p38 MAPK（1∶1 000）、BMP2（1∶500）、COLⅠ（1∶500）、GAPDH（1∶2 000），放入4℃冰箱内过夜。第2天加入羊抗兔二抗（1∶5 000），37℃条件下孵育1 h，洗膜后加入发光液显影，数字成像系统检测蛋白条带，Image J软件分析其灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0软件分析数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MC3T3-E1细胞在不同时间点增殖水平的比较在细胞培养24、48、72 h后，LG组、LG+ZOL组、HG组、HG+ZOL组MC3T3-E1细胞增殖活性差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图1。

Fig.1 The proliferation levels of cells detected by MTT assay at different time points图1 MTT法检测不同时间点细胞的增殖水平

2.2 各组MC3T3-E1细胞骨架清晰程度及细胞数量比较染色结果显示，与LG组相比，LG+ZOL组细胞骨架更为清晰，细胞数目增多，HG组细胞微丝排列紊乱，细胞内部结构不甚清晰且细胞数目少（P＜0.05）；与HG组相比，HG+ZOL组细胞骨架清晰程度有所提升，细胞内部构造更为清晰，细胞伸展良好且数目增多（P＜0.05），见图2。

2.3 各组MC3T3-E1细胞ALP活性比较与LG组相比，LG+ZOL组ALP活性升高，HG组ALP活性降低（P＜0.05）；HG+ZOL组ALP活性较HG组升高（P＜0.05），见图3。

2.4 各组MC3T3-E1细胞矿化结节结果比较与LG组相比，LG+ZOL组矿化结节形成大而多，HG组矿化结节量少（P＜0.05）；与HG组相比，HG+ZOL组矿化结节增多（P＜0.05）。见图4。

Fig.2 The cell cytoskeleton clarity of cells detected by phalloidin staining图2鬼笔环肽染色检测细胞骨架的清晰度及细胞数量

Fig.3 Comparison of the ALP activity between the four groups of cells图3各组细胞ALP活性的比较

2.5 各组MC3T3-E1细胞Wnt5a、p38 MAPK表达结果 比 较与LG组 相 比，LG+ZOL组Wnt5a、p38 MAPK的荧光表达强度明显增加，HG组Wnt5a、p38 MAPK的荧光表达强度明显下降（P＜0.05）；与HG组相比，HG+ZOL组Wnt5a、p38 MAPK的荧光表达强度增加（P＜0.05），见图5。

2.6 各组MC3T3-E1细胞中Wnt5a、p38 MAPK、pp38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表达水平的比较Western blot结果显示，与LG组相比，LG+ZOL组Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表达明显增加，HG组上述蛋白表达明显下降（P＜0.05）；与HG组相比，HG+ZOL组上述蛋白表达增加（P＜0.05）；HG+ZOL+SB203580组MC3T3-E1细胞中上述蛋白表达与HG+ZOL组相比明显减少（P＜0.05），见表1、图6。

Fig.4 The generation of mineralized nodules of cells detected by alizarin red staining图4茜素红染色法检测细胞的矿化结节的生成

3 讨论

3.1 高糖抑制MC3T3-E1细胞成骨分化目前，DOP的发病率不断上升，其骨折风险随着病程和血糖控制不佳而增加［7-8］。DOP的病因机制是多方面的，目前尚不清楚其确切的发病机制。COLⅠ被认为是一种重要的结构蛋白，与成骨分化密切相关［9］。有研究指出，高糖状态下糖基化终末产物的形成可减少COLⅠ的形成并抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化［10］。Doherty等［11］认为，高糖状态下会使得骨膜细胞的增殖能力以及成骨活性降低，导致骨形成减少，骨骼愈合能力严重受损。此外，MC3T3-E1细胞骨架除维持形态外，还可积极参与细胞的增殖、分化过程，进而影响骨形成［12］。本研究结果显示，相较于LG组，HG组细胞的骨架清晰度、ALP活性、矿化结节生成情况及成骨标志物BMP2、COLⅠ蛋白表达水平均有所下降。以上结果表明，在高糖微环境下MC3T3-E1细胞成骨分化能力被减弱。

3.2 低浓度ZOL促进高糖微环境下MC3T3-E1细胞成骨分化BPs是DOP患者的一线治疗药物［13］。目前，ZOL的相关报道多关于破骨细胞，其可有效抑制破骨细胞的分化，进而抑制骨吸收［14-15］。同时，有研究指出ZOL浓度对于间充质干细胞有着双重作用，低浓度促进其成骨分化，高浓度则抑制［16］。而国内外关于低浓度ZOL对MC3T3-E1细胞的成骨分化调节作用以及在高糖微环境下的相关机制仍未明确。在本研究中选用0.1 μmol/L ZOL对MC3T3-E1细胞进行干预，结果显示LG+ZOL组较LG组，HG+ZOL组较HG组的细胞骨架清晰度、ALP活性、矿化结节生成情况及成骨相关蛋白BMP2、COLⅠ蛋白表达水平均显著升高。由此提示低浓度的ZOL对MC3T3-E1细胞成骨分化有促进作用，同时可有效改善高糖微环境下对其成骨分化的抑制。

3.3 ZOL通过p38 MAPK信号途径影响高糖微环境下MC3T3-E1细胞的成骨分化作为MAPK家族中的一个重要成员，p38 MAPK信号途径参与了不同细胞中各种细胞因子的成骨调节过程［17］。除了MAPK，Wnt家族在成骨方面也发挥着关键作用。Wnt5a是Wnt蛋白家族非经典途径中最具代表性的蛋白，其可通过Wnt/平面细胞极性或Wnt/Ca2+途径来实现其功能［18］。研究表明，靶向干预Wnt5a可能是改善代谢性骨骼疾病（如骨质疏松症）的可行策略［19］。因此，Wnt5a及其相关信号通路可能是骨相关疾病治疗的重要作用靶点。但是，在高糖微环境下ZOL对于MC3T3-E1细胞成骨分化的确切机制尚有待阐明。本研究在Western blot实验中增加了HG+ZOL+SB203580组。实验结果显示，HG+ZOL+SB203580组Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表达水平相比于HG+ZOL组下降，进一步提示p38 MAPK通路可能参与了调节高糖微环境下ZOL对MC3T3-E1细胞的成骨分化过程。而Wnt5a蛋白的变化进一步提示p38 MAPK通路和Wnt途径可能共同参与介导了MC3T3-E1细胞的成骨分化过程。

Fig.5 The fluorescence expression intensity of Wnt5a and p38 MAPK detected by immunofluorescence staining图5免疫荧光染色检测Wnt5a和p38 MAPK的荧光表达强度

Tab.1 Relative expression of Wnt5a,p38 MAPK,p-p38 MAPK,BMP2 and COLⅠproteins in cells表1细胞中Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表达 （n=3，±s）

Tab.1 Relative expression of Wnt5a,p38 MAPK,p-p38 MAPK,BMP2 and COLⅠproteins in cells表1细胞中Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表达 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与LG组比较，b与LG+ZOL组比较，c与HG组比较，d与HG+ZOL组比较，P＜0.05。

组别LG组LG+ZOL组HG组HG+ZOL组HG+ZOL+SB203580组F Wnt5a 1.00±0.00 1.33±0.08a 0.64±0.09ab 1.10±0.11bc 0.54±0.06abd 53.354＊＊p38 MAPK 1.00±0.00 1.38±0.18a 0.57±0.08ab 0.88±0.05bc 0.52±0.10abd 35.789＊＊p-p38 MAPK 1.00±0.00 1.81±0.25a 0.49±0.09ab 0.85±0.08bc 0.43±0.07abd 56.242＊＊BMP2 1.00±0.00 1.21±0.07a 0.64±0.05ab 1.14±0.09ac 0.35±0.05abcd 110.142＊＊COLⅠ1.00±0.00 1.25±0.08a 0.81±0.06ab 1.05±0.07bc 0.70±0.07abd 34.826＊＊

Fig.6 Relative expression of Wnt5a,p38 MAPK,p-p38 MAPK,BMP2 and COLⅠproteins in cells图6细胞中Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表达

综上所述，高糖可抑制MC3T3-E1细胞成骨分化，在加入低浓度ZOL后可改善高糖的抑制作用，这可能与抑制p38 MAPK通路有关。同时，可考虑靶向干预Wnt5a，进而通过p38 MAPK通路和Wnt途径的联合作用来调节MC3T3-E1细胞的成骨分化过程，可为药物治疗DOP提供一定的理论依据，详细机制仍需要进一步研究。