外周血单个核细胞TLR2 mRNA和TLR4 mRNA对泌尿系结石患者术后并发尿源性脓毒血症的诊断效能

王瑞，郝井志，刘晓琳

1.延安大学咸阳医院检验科，陕西 咸阳 712000；2.延安大学咸阳医院脑血管病研究所，陕西 咸阳 712000

尿源性脓毒血症是泌尿系结石术后严重并发症[1-2]。据报道，经皮肾镜术后尿源性脓毒血症发生率女性为10.9%，男性为1.4%，且其病死率高达30.0%～40.0%，若未予以及时有效干预，随病情发展可演变为感染性休克，威胁患者生命安全[3-4]。因此，早期筛查与预防尤为必要。目前临床诊断尿源性脓毒血症主要通过体温变化、心律失常、血常规等，虽具有一定预防指导意义，但其无法明确病情发展程度，不利于实施个性化治疗方案[5]。近年来，相关研究认为，尿源性脓毒血症是一个复杂、多阶段且动态的综合征症状，其病理机制涉及复杂的全身炎症网络效应、免疫功能障碍、组织损伤及宿主对感染的反应等诸多方面[6-8]。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)主要包括淋巴细胞和单核细胞等，是机体抵抗感染的重要免疫细胞类型。而Toll样受体(toll like receptors，TLRs)不仅是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫、特异性免疫的桥梁，是机体抗感染与损伤的第一道防线，表达于PBMCs表面，发生感染时TLR2 mRNA、TLR4 mRNA可迅速被激活，并能调控PBMCs对感染的应答过程，在免疫性炎症疾病中起着重要作用，因此推测PBMCs表面TLR2 mRNA、TLR4 mRNA与泌尿系结石患者术后并发尿源性脓毒血症有关，但现阶段关于这方面的研究鲜见[9]。为此，本研究尝试探讨外周血单个核细胞TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达与泌尿系结石患者术后并发尿源性脓毒血症的关系，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019年1月至2021年4月延安大学咸阳医院收治的59例泌尿系结石术后并发尿源性脓毒血症患者(观察组)、59例泌尿系结石术后单纯泌尿系感染患者(对照B组)、59例泌尿系结石术后无泌尿系感染患者(对照A组)进行前瞻性研究。观察组患者中普通尿源性脓毒血症26例、严重尿源性脓毒血症22例和感染性休克11例。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 诊断标准

1.2 .1 单纯泌尿系感染诊断标准[10]泌尿系结石术后，尿常规检查见大量的白细胞甚至脓球，尿液细菌培养检出细菌菌株。

1.2 .2 尿源性脓毒血症的诊断标准(1)泌尿系结石术后，尿常规检查见大量的白细胞甚至脓球，尿液细菌培养检出细菌菌株。(2)满足以下≥2项：A，心率＞各年龄组正常平均值2个标准差；B，体温＜36℃或＞38℃；C，呼吸频率＞各年龄组正常平均值2个标准差或需机械通气；D，血白细胞＞12×109/L或＜4×109/L，或杆状核细胞＞10%，且出现威胁生命的器官功能障碍，如意识改变、呼吸频率≥22次/min、收缩压≤100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)等。

1.2 .3 尿源性脓毒血症病情评估(1)普通尿源性脓毒血症：①泌尿系结石术后，尿常规检查见大量的白细胞甚至脓球，尿液细菌培养检出细菌菌株。②满足以下≥2项：A，心率＞各年龄组正常平均值2个标准差；B，体温＜36℃或＞38℃；C，呼吸频率＞各年龄组正常平均值2个标准差或需机械通气；D，血白细胞＞12×109/L或＜4×109/L，或杆状核细胞＞10%，且出现威胁生命的器官功能障碍，如意识改变、呼吸频率≥22次/min、收缩压≤100 mmHg等。(2)严重尿源性脓毒血症：在普通尿源性脓毒血症基础上，出现急性器官功能衰竭(满足至少1项)：①脑(精神症状)，烦躁、嗜睡、昏迷、意识混乱；②血小板＜80 000/μL或3 d内降低＞50%；③心脏、循环系统，平均动脉压≤70 mmHg或动脉收缩压≤90 mmHg；④代谢酸中毒，剩余碱≥5 mmol/L或血pH≤7.30或血乳酸根≥正常1.5倍；⑤肺，氧化指数≤250或动脉氧分压≤75 mmHg；⑥肾，尿量＜0.5 mL/(kg·h)。(3)感染性休克：在严重尿源性脓毒血症基础上，需血管活性药物维持收缩压＞90 mmHg或平均动脉压＞65 mmHg或收缩压≤90 mmHg至少1 h，出现补充容量不能纠正的低血压[11]。

1.3 纳排标准(1)纳入标准：①各组符合以上对应的尿源性脓毒血症、单纯泌尿系感染诊断标准；②对照A组为泌尿系结石术后无泌尿系感染患者；③均符合泌尿系结石术指征。(2)排除标准：①入院前近7 d内有抗菌药物治疗史者；②泌尿系结石术前明确感染者；③阿尔茨海默症、老年痴呆或精神行为异常者；④其余慢性疾病或恶性疾病者。

1.4 检测方法

1.4 .1 主要试剂仪器降钙素原(procalcitonin，PCT)试剂盒购自上海透景生命科技股份有限公司；C-反应蛋白(C-reactionprotein，CRP)试剂盒购自北京森美希克玛生物科技有限公司；Trizol总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司；PCR试剂盒(美国Invitrogen公司)；全自动免疫发光仪(雅培i2000)；血细胞分析仪(美国贝克曼-库尔特公司的HMX型)；实时荧光PCR仪(美国ABI公司PE-7900HT型)。

1.4 .2 经典炎症标志物检测于确诊后(术后3 d内)取9 mL肘静脉血，采用血细胞分析仪测定白细胞(white blood cell，WBC)；采用化学发光免疫法检测血清PCT水平，采用免疫比浊法检测血清CRP水平。

1.4 .3 TLR2 mRNA、TLR4 mRNA检测取上述所采集的血标本2 mL，采用密度梯度离心法分离人PBMCs，加入2 mL Hank’s液混匀，沿食管壁缓慢加入到2 mL分离液中，2 000 r/min离心20 min，小心吸取灰白色层的单个核细胞，置于另一离心管中，用5倍体积的Hank’s液将所获得的PBMCs悬液洗涤2次，1 500 r/min离心5 min，计数细胞，调整为5×109个/L。Trizol提取总RNA，逆转录后，取逆转录产物实施聚合酶链反应(PCR)扩增。各基因引物序列及其产物见表1。混合物充分混匀后，置于PCR仪中扩增，反应条件依次为：TLR2，95℃变性5 min，95℃30 s，退火60℃30 s，72℃30 s，循环35次，72℃延伸10 min；TLR4，95℃变性5 min，95℃30 s，退火50℃30 s，72℃30 s，循环30次，72℃延伸10 min。实施琼脂糖凝胶电泳、上样，凝胶成像，采用凝胶图像分析软件定量，TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达量以相对内参表示，见表1。

表1 各基因引物序列及其产物

1.5 统计学方法应用SPSS22.0统计学软件分析数据。计数资料以例数描述，采用χ2检验；计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)描述，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两组间比较采用SNK-q检验，两组间比较采用独立样本t检验；TLR2 mRNA、TLR4 mRNA与经典炎症标志物的相关性采用Spearman分析；并发尿源性脓毒血症的相关影响因素采用多因素Logistic回归分析；TLR2 mRNA、TLR4 mRNA对尿源性脓毒血症的诊断价值采用受试者工作特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲线，获取曲线下面积(AUC)、置信区间、敏感度、特异度及Cut-off值。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组患者的一般资料比较三组患者年龄、性别、体质量指数、手术方式、结石类型比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 三组患者的一般资料比较[±s，例(%)]

表2 三组患者的一般资料比较[±s，例(%)]

观察指标年龄(岁)性别(男/女)体质量指数(kg/m2)手术方式经皮肾镜取石输尿管软镜钬激光碎石输尿管镜下气压弹道碎石结石类型肾结石尿路结石观察组(n=59)59.77±6.03 35(59.32)/24(40.68)22.37±1.98 24(40.68)23(38.98)12(20.34)28(47.46)31(52.54)对照B组(n=59)60.08±5.86 38(64.41)/21(35.59)22.42±2.04 23(38.98)26(44.07)10(16.95)27(45.76)32(54.24)对照A组(n=59)59.83±5.95 34(57.63)/25(42.37)22.35±1.92 27(45.76)21(35.59)11(18.64)30(50.85)29(49.15)F/χ2值0.045 0.614 0.020 1.076 0.317 P值0.956 0.736 0.981 0.898 0.854

2.2三组患者的血清PCT、CRP、WBC和TLR2 mRNA、TLR4 mRNA比较观察组患者的PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA明显高于对照B组、对照A组，且对照B组患者的PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA明显高于对照A组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 三组患者的血清PCT、CRP、WBC和TLR2 mRNA、TLR4 mRNA比较(±s)

表3 三组患者的血清PCT、CRP、WBC和TLR2 mRNA、TLR4 mRNA比较(±s)

注：与观察组比较，aP＜0.05；与对照B组比较，bP＜0.05。

观察指标PCT(μg/L)CRP(mg/L)WBC(×109/L)TLR2 mRNA TLR4 mRNA观察组(n=59)5.89±1.15 35.59±5.62 14.35±3.52 5.68±1.24 3.94±1.01对照B组(n=59)0.61±0.13a 12.45±3.78a 12.94±1.87a 2.34±0.50a 1.26±0.33a对照A组(n=59)0.14±0.05ab 7.25±2.16ab 8.62±1.33ab 1.06±0.15ab 0.97±0.18ab F/χ2值1 344.566 797.153 89.360 556.369 408.626 P值0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

2.3 观察组不同病情患者的一般资料比较观察组不同病情患者的年龄、性别、体质量指数、手术方式、结石类型比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表4。

表4 观察组不同病情患者的一般资料比较[±s，例(%)]

表4 观察组不同病情患者的一般资料比较[±s，例(%)]

观察指标年龄(岁)男/女体质量指数(kg/m2)手术方式经皮肾镜取石输尿管软镜钬激光碎石输尿管镜下气压弹道碎石结石类型肾结石尿路结石普通尿源性脓毒血症(n=26)59.43±8.19 16(61.54)/10(38.46)22.45±2.20 10(38.46)9(34.62)7(26.92)11(42.31)15(57.69)严重尿源性脓毒血症(n=22)60.26±9.37 11(50.00)/11(50.00)22.29±2.13 9(40.91)8(36.36)5(22.73)10(45.45)12(54.55)感染性休克(n=11)59.59±10.01 8(72.73)/3(27.27)22.34±2.05 5(45.45)6(54.55)0 7(63.64)4(36.36)F/χ2值0.054 1.664 0.034 3.796 1.467 P值0.948 0.435 0.966 0.434 0.480

2.4 TLR2 mRNA、TLR4 mRNA与经典炎症标志物的相关性经Spearman分析结果显示，TLR2 mRNA与PCT(r=0.906)、CRP(r=0.900)、WBC(r=0.897)呈 正 相 关(P＜0.05)，TLR4 mRNA与PCT(r=0.873)、CRP(r=0.933)、WBC(r=0.916)呈正相关(P＜0.05)，见图1。

图1 TLR2、TLR4 mRNA与经典炎症标志物的相关性

2.5 泌尿系结石术后并发尿源性脓毒血症的影响因素经多因素Logistic回归分析结果显示，PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA均是并发尿源性脓毒血症的相关影响因素(P＜0.05)，见表5。

表5 泌尿系结石术后并发尿源性脓毒血症影响因素的多因素Logistic回归分析

2.6 TLR2 mRNA、TLR4 mRNA诊断尿源性脓毒血症的效能经ROC分析结果显示，TLR2 mRNA诊断并发尿源性脓毒血症的AUC为0.829(95% CI：0.748～0.892)，高于PCT、CRP、WBC的AUC(Z=4.188，P=0.000；Z=2.696，P=0.034；Z=4.592，P=0.000)；TLR4 mRNA诊断并发尿源性脓毒血症的AUC为0.838(95% CI：0.759～0.900)，高于PCT、CRP、WBC的AUC(Z=4.054，P=0.000；Z=2.436，P=0.045；Z=4.530，P=0.000)，见图2、表6。

表6 各指标诊断尿源性脓毒血症的效能

图2 各指标诊断尿源性脓毒血症的ROC

2.7 观察组不同病情患者PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达比较感染性休克患者PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA高于严重尿源性脓毒血症患者、普通尿源性脓毒血症患者，差异有统计学意义(P＜0.05)；严重尿源性脓毒血症患者PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA高于普通尿源性脓毒血症患者，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表7。

表7 不同病情患者PCT、CRP、WBC、TLR2、TLR4 mRNA表达比较(±s)

表7 不同病情患者PCT、CRP、WBC、TLR2、TLR4 mRNA表达比较(±s)

注：与普通尿源性脓毒血症比较，aP＜0.05；与严重尿源性脓毒血症比较，bP＜0.05。

观察指标PCT(μg/L)CRP(mg/L)WBC(×109/L)TLR2 mRNA TLR4 mRNA普通尿源性脓毒血症(n=26)3.64±1.03 25.14±4.84 12.01±2.76 3.59±1.03 2.11±0.98严重尿源性脓毒血症(n=22)6.15±1.22 38.22±8.64 14.82±3.25 3.59±1.03 4.26±1.05a感染性休克(n=11)10.69±1.35 55.03±11.82 18.94±4.38 10.46±1.57ab 7.63±1.15ab F值142.407 56.376 17.566 127.111 110.865 P值0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

3 讨论

目前临床检测泌尿系结石术后并发尿源性脓毒血症指标较多，如经典炎症标志物中的PCT、CRP、WBC等，但上述指标检测敏感度、特异度差异较大，且对年龄较大患者，发生严重感染时WBC降低和升高表现不一，可能影响后续治疗[12]。因此，积极探索泌尿系结石术后并发尿源性脓毒血症检测的新指标是目前临床亟需解决的难点与重点。

Toll样受体是固有免疫系统中的重要模式识别受体，可对病原相关分子模式(PAMPs)与损伤相关分子模式(DAMPs)做出反应，从而成为机体抗感染与损伤的第一道防线[13-14]。TLR2作为病原微生物的PAMPs识别受体，可识别多聚糖，能快速启动致病因子信号转导过程，释放大量炎性介质，进而在抗感染免疫中发挥重要生物学作用[15-16]。同时，相关研究显示，TLR4可识别脂多糖，激发机体炎性反应，参与免疫炎性疾病发展进程[17-18]。本研究数据表明，泌尿系结石术后并发尿源性脓毒血症患者TLR2 mRNA、TLR4 mRNA高于单纯泌尿系感染患者、无泌尿系感染患者，提示TLR2 mRNA、TLR4 mRNA与并发尿源性脓毒血症有关。韩冬等[19]报道，脓毒症患者TLR2表达升高，本研究结论与之存在相似之处。泌尿系结石术后并发尿源性脓毒血症导致病原微生物大量增殖与入侵，引发机体抵抗力下降，产生大量内毒素，活化单核细胞、巨噬细胞及中性粒细胞等，生成大量白细胞介素1、肿瘤坏死因子-α等前炎性反应细胞因子，最终启动适应性免疫，诱发炎性反应瀑布链，主要表现为TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达上调[20]。

另外，CRP、PCT、WBC是炎性标记物，可释放多种炎症细胞因子，加重炎症反应[21-23]。本研究结果发现，观察组PCT、CRP、WBC高于对照B组、对照A组，是并发尿源性脓毒血症的相关影响因素。ROC分析显示，PCT、CRP、WBC对并发尿源性脓毒血症具有一定评估价值。且本研究经Spearman相关性分析创新性发现，TLR2 mRNA、TLR4 mRNA与PCT、CRP、WBC均存在正相关性，提示TLR2 mRNA、TLR4 mRNA可作为炎症标志物，可能有助于评估泌尿系结石术后并发尿源性脓毒血症。由于革兰氏阴性菌是尿源性脓毒血症形成的主要致病菌，而革兰氏阴性菌细胞壁毒性成份LPS通过结合脂多糖结合蛋白(LBP)、细胞表面可溶性分化抗原簇14(CD14)，可形成LPS-LBP-CD14复合物，进而激活TLR4通路，并通过下游髓样分化蛋白88(MyD88)依赖途径与非MyD88依赖途径，活化核因子κB(NF-κB)信号传导通路，释放大量炎性因子，从而加重机体炎症反应，引发炎症级联反应[24-26]。由此可见，TLR2 mRNA、TLR4 mRNA可能是通过调节泌尿系结石术后并发尿源性脓毒血症患者体内炎症反应，在疾病发展中起促进作用。在以上研究基础上，本研究通过绘制ROC曲线还发现，TLR2 mRNA诊断并发尿源性脓毒血症的AUC高于PCT、CRP、WBC的AUC，提示TLR2 mRNA、TLR4 mRNA对泌尿系结石术后并发尿源性脓毒血症诊断价值高于常规炎症标志物，提示早期检测外周血单个核细胞TLR2 mRNA、TLR4 mRNA，有望为临床诊断泌尿系结石术后并发尿源性脓毒血症提供有效辅助手段。

此外，本研究数据还表明，TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达越高，患者病情越严重，结合王玉浔等[27]、陈欧等[28]研究分析机制可能与TLR2 mRNA、TLR4 mRNA介导生成肿瘤坏死因子-α、白细胞介素1等促炎介质，反过来进一步上调TLRs基因表达蛋白合成，进而形成正反馈，不断放大炎症反应，致使炎症反应失调，最终引起感染性休克发生有关。推测抑制TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达可能是阻断泌尿系结石术后并发尿源性脓毒血症病情进展的重要原因，但具体机制仍需今后进一步论证，这也是今后的一个研究方向。

综上所述，泌尿系结石术后并发尿源性脓毒血症患者存在TLR2 mRNA、TLR4 mRNA升高现象，早期检测上述指标可为临床诊断、病情程度评估提供循证指导。