没食子酸对急性呼吸衰竭大鼠的治疗作用及机制

张春梅， 胡利容， 郑建伟， 胡小红

（1.西南医科大学附属医院合江医院重症医学科，四川泸州 646200；2.西南医科大学附属医院重症医学科，四川泸州 646200；3.合江县人民医院重症医学科，四川合江 646200）

急性呼吸衰竭（acute respiratory failure）是由于中枢系统或呼吸系统原发或继发性病变，引起通气或换气功能障碍，致使呼吸系统吸入O2和排出CO2功能因不能满足机体的代谢需要而导致呼吸不畅的危重临床综合征[1]。随着中医急症抢救水平的日益提高，中医药也逐渐参与了呼吸衰竭的抢救治疗，成为研究热点。没食子酸作为中药材五倍子、石榴、掌叶大黄等的主要成分之一，是化学结构最简单的天然多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理学作用[2]。既往研究[3-4]表明，没食子酸可改善大鼠放射性肺损伤、脓毒症大鼠急性肺损伤，起到肺保护作用。本研究进一步探讨没食子酸治疗急性呼吸衰竭大鼠的作用机制，以期为临床应用没食子酸改善肺损伤提供依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物取40只SPF级健康成年雌雄参半的SD大鼠，6~8周龄，体质量180~300 g，由湖南中医药大学动物学部提供，动物生产许可证号：SCXK（湘）2020-0015。本实验在西南医科大学附属医院实验室完成。整个实验过程按照《实验动物管理条例》规定进行。

1.2药物、试剂与仪器没食子酸（分子式：C7H6O5，分子量：170.12，纯度＞99%，成都曼思特生物科技有限公司生产，批号：16022801）；硫酸阿托品注射液（上海禾丰制药有限公司，批号：国药准字H31021171，规格：1 mL∶1 mg）。白细胞介素（IL）-8、IL-17酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（美国eBioscience公司）；超敏C反应蛋白（hs-CRP）ELISA试剂盒（上海心语生物科技有限公司）；兔抗大鼠磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK）抗体、Smad3抗体、Smad7抗体（武汉博士德生物工程有限公司）。动物肺功能检测仪（长沙百禾仪器设备有限公司）；血气分析仪（四川金域医学检验中心有限公司）；JZ100张力换能器（高碑店市新航机电设备有限公司）。

1.3分组、建模与给药将40只大鼠随机分为正常组、模型组、阿托品组、没食子酸组，每组10只。除正常组外，其余各组大鼠参考文献研究[5]建立急性呼吸衰竭模型。方法：将大鼠麻醉后固定在操作台上，进行支气管插管，支气管滴入5 mg/kg大肠杆菌脂多糖。造模结束后，依据血气分析结果，若动脉血二氧化碳分压（PaCO2）＜35 mmHg、动脉血氧分压（PaO2）＜75 mmHg，则判断建模成功[5]。建模成功后，没食子酸组大鼠给予没食子酸溶液20 mg/kg灌胃[6]，阿托品组大鼠腹腔注射0.1 mL硫酸阿托品注射液，正常组、模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，每日1次，干预7 d。

1.4观察指标与方法

1.4.1 呼吸功能监测与血气分析 应用动物肺功能检测仪器记录大鼠呼吸频率，血气分析仪检测酸碱度（pH）、PaO2、PaCO2。

1.4.2 ELISA法检测血清IL-8、IL-17、hs-CRP水平 按照试剂盒说明书操作，应用酶标仪于500 nm波长处检测光密度（OD）值，根据标准曲线和OD值计算IL-8、IL-17、hs-CRP的含量。

1.4.3 离体膈肌张力测定 脱颈处死大鼠，取出膈肌条，清理表层肌肉组织，放入盛满37℃Kreb’s液并连续输入95%CO2和5%CO2混合气体的麦氏浴槽中。将一端固定在浴槽底部，另一端连接张力换能器并固定在微调器上，调节膈肌条至适宜长度（L0）。稳定放置20 min后，把2个铂金丝电极放置于肋条两边，将电子刺激器设置参数为电压20 V刺激膈肌条。应用Medlab-U/4c生物信号采集处理系统测量膈肌张力参数颤搐收缩张力（Pt）、强直颤搐收缩张力（P0）、疲劳指数（FI）。

1.4.4 苏木素-伊红（HE）染色法观察肺组织病理变化 脱颈处死大鼠，取肺组织固定，脱水、石蜡包埋，制作厚度为5 μm的切片，-20℃保存。脱蜡后，蒸馏水冲洗，苏木素染色15 min，流水冲洗，乙醇水化，流水冲洗，伊红染色3 min，流水冲洗，脱水，封片，显微镜观察。

1.4.5 蛋白质免疫印迹（Western Blot）法检测肺组织p-ERK、Smad3、Smad7蛋白表达 取肺组织，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液于冰上裂解后，离心取上清液测蛋白浓度。将蛋白样品与上样缓冲液按5∶1混匀，沸水浴5 min。配制10%~15%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离胶和5%的浓缩胶。上样，跑胶，转膜，丽春红染色。加入5%脱脂奶粉置于摇床上30 r/min振荡封闭1 h，再分别加入兔抗大鼠一抗稀释液p-ERK（1∶5 000）、Smad3（1∶7 500）、Smad7（1∶3 000）、β-actin（1∶2 000），4℃振荡孵育过夜。次日，TBST洗涤，加入羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二抗稀释液（1∶2 000），室温振荡孵育1 h，TBST洗涤后增强化学发光法（ECL）显影。以β-actin为内参。采用IPP 6.0软件进行分析，结果以目标蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值比值表示。

1.5统计方法采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠呼吸频率及pH值、PaCO2、PaO2比较表1结果显示：与正常组比较，模型组大鼠呼吸频率及pH值、PaCO2、PaO2降低（P＜0.05）；与模型组比较，没食子酸组和阿托品组大鼠呼吸频率及pH值、PaCO2、PaO2均升高（P＜0.05）；与阿托品组比较，没食子酸组呼吸频率及pH值、PaCO2、PaO2升高（P＜0.05）。

表1 各组大鼠呼吸频率、pH值、PaCO2、PaO2比较Table1 Comparison of respiratory rate，pH，PaCO2 and PaO2 among various groups of rats （±s）

表1 各组大鼠呼吸频率、pH值、PaCO2、PaO2比较Table1 Comparison of respiratory rate，pH，PaCO2 and PaO2 among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与阿托品组比较

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2.2各组大鼠血清中IL-8、IL-17及hs-CRP水平比较表2结果显示：与正常组比较，模型组大鼠血 清 中IL-8、IL-17及hs-CRP水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，没食子酸组和阿托品组IL-8、IL-17及hs-CRP水平均降低（P＜0.05）；与阿托品组比较，没食子酸组IL-8、IL-17及hs-CRP水平降低（P＜0.05）。

表2 各组大鼠血清白细胞介素（IL）-8、IL-17、超敏C反应蛋白（hs-CRP）水平比较Table 2 Comparison of serum IL-8，IL-17 and Hs-CRP levels among various groups of rats （±s）

表2 各组大鼠血清白细胞介素（IL）-8、IL-17、超敏C反应蛋白（hs-CRP）水平比较Table 2 Comparison of serum IL-8，IL-17 and Hs-CRP levels among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与阿托品组比较

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2.3各组大鼠膈肌收缩功能的比较表3结果显示：模型组大鼠膈肌Pt、P0、FI值均低于正常组；与模型组比较，没食子酸组和阿托品组大鼠膈肌Pt、P0、FI值升高（P＜0.05）；与阿托品组比较，没食子酸组膈肌Pt、P0、FI值升高（P＜0.05）。

表3 各组大鼠膈肌颤搐收缩张力（Pt）、强直颤搐收缩张力（P0）、疲劳指数（FI）比较Table 3 Comparison of diaphragm function Pt，P0 and FI among various groups of rats （±s）

表3 各组大鼠膈肌颤搐收缩张力（Pt）、强直颤搐收缩张力（P0）、疲劳指数（FI）比较Table 3 Comparison of diaphragm function Pt，P0 and FI among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与阿托品组比较

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2.4各组大鼠肺组织病理学变化比较图1结果显示：正常组肺泡完整且大小均匀，肺泡腔内干净，肺泡间隔保持一致，无增厚现象；模型组肺泡毛细血管壁有明显充血现象，肺泡间隔增厚并伴有水肿和炎症细胞浸润；阿托品组肺泡腔有少量充血，肺泡间隔不同程度增厚，有部分炎症细胞浸润，少量肺泡血肿；与模型组比较，没食子酸组肺泡内壁清洁度升高，肺泡间隔变薄，毛细血管充血、水肿、炎症细胞浸润减轻，且肺组织改善情况优于阿托品组。

图1 各组大鼠肺组织病理学变化比较（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of histopathological changes in lung tissues among various groups of rats（by HE staining，100）

2.5各组大鼠肺组织中p-ERK、Smad3、Smad7蛋白表达比较表4、图2结果显示：与正常组比较，模型组大鼠肺组织p-ERK、Smad3蛋白表达水平升高，Smad7蛋白表达水平降低（均P＜0.05）；与模型组比较，没食子酸组和阿托品组大鼠肺组织中p-ERK、Smad3蛋白表达水平降低，Smad7蛋白表达水平升高（均P＜0.05）；与阿托品组比较，没食子酸组肺组织中p-ERK、Smad3蛋白表达水平更低，Smad7蛋白表达水平更高（均P＜0.05）。

表4 各组大鼠肺组织磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK）、Smad3、Smad7蛋白表达水平比较Table 4 Comparison of the protein expression levels of p-ERK，Smad3 and Smad7 in lung tissues among various groups of rats

图2 各组大鼠肺组织磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK）、Smad3、Smad7的Western Blot电泳条带图Figure 2 Western Blotting electrophoretic bands of p-ERK，Smad3 and Smad7 in lung tissues in various groups of rats

3 讨论

急性呼吸衰竭时，pH值、PaCO2、PaO2等血气分析指标会明显异常。检测血气分析指标pH值、PaCO2、PaO2水平，可对急性呼吸衰竭症状严重程度以及临床治疗效果进行较为准确的评价[7]。本研究结果显示，急性呼吸衰竭模型组大鼠呼吸频率及pH值、PaCO2、PaO2值较正常组明显降低，而没食子酸组大鼠呼吸频率及pH值、PaCO2、PaO2值较模型组明显上升，表明没食子酸可改善急性呼吸衰竭大鼠肺通气与换气功能和酸碱失衡。

膈肌是主要的呼吸肌，膈肌的张力、耐力降低是发生膈肌疲劳、呼吸困难的主要原因[8-9]。急性呼吸衰竭时，因呼吸衰竭过程中肌纤维蛋白含量减少，收缩蛋白或细胞骨架蛋白的异常和兴奋-收缩耦联功能的障碍，膈肌收缩能力降低[10]。本研究结果显示，模型组大鼠膈肌颤搐收缩张力（Pt）、强直颤搐收缩张力（P0）、疲劳指数（FI）值均较正常组减弱，而没食子酸组大鼠Pt、P0、FI值较模型组上升，且趋于正常组大鼠膈肌功能水平，结果表明，没食子酸可抑制急性呼吸衰竭大鼠膈肌功能紊乱，缓解膈肌的疲劳程度，恢复膈肌耐力，调节膈肌的张力。

急性呼吸衰竭的发生伴随着过度失控的炎症反应[11]。IL-8、IL-17、hs-CRP是广谱的炎症指标[5]。IL-8主要来源于单核巨噬细胞，对中性粒细胞有较强的趋化和激活作用，参与局部炎症的形成[12]。IL-17是具有强大促炎作用的细胞因子，主要由Th17细胞分泌，IL-17能有效地介导中性粒细胞募集和活化过程，从而引起组织的炎症反应[13]。hs-CRP是体内最常见的急性时相反应蛋白，作为炎症反应标志物[14]。本研究结果显示，模型组大鼠血清中IL-8、IL-17、hs-CRP水平较正常组升高，而没食子酸组大鼠血清IL-8、IL-17、hs-CRP水平较模型组明显下降。病理结果还显示，模型组肺泡毛细血管壁明显充血，肺泡间隔增宽且有水肿和炎症发生，经没食子酸干预治疗后大鼠肺泡内壁清洁度明显升高。表明没食子酸可减轻急性呼吸衰竭大鼠肺部急性炎症反应，保护肺功能。

细胞外调节蛋白激酶（ERK）是p38MAPK通路关键的信号物质，包括ERK1和ERK2，是将信号从细胞表面受体传导至细胞核的关键酶。磷酸化激活的ERK1/2由胞质转位到核内，进而介导Elk-1、ATF、NF-κB、Ap-1、c-fos和c-Jun的转录活化，参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡等多种生物学反应[15]。还有研究表明，特异性阻断ERK后可以明显降低各种原因引起的肺部损伤和炎症反应[16]。本研究结果显示，模型组大鼠肺组织p-ERK蛋白表达水平较正常组显著升高，表明急性呼吸衰竭ERK信号传导通路在翻译和转录水平上被大量激活，在急性呼吸衰竭的发病机制过程中发挥重要作用。经没食子酸干预治疗后的大鼠肺组织ERK蛋白磷酸化水平较模型组降低，表明没食子酸可抑制急性呼吸衰竭大鼠肺组织ERK的活化，从而起到肺保护作用。

转化生长因子（TGF）-β是急性肺损伤的关键调节因子[17]。Smads是细胞内重要的TGF-β信号转导和调节分子，可以将TGF-β信号直接由细胞膜转导入细胞核内。TGF-β1蛋白多种功能的发挥均依赖Smads蛋白的信号转导及调控。最具有代表意义的是Smad3、Smad7，其中，Smad3是受体活化的Smads，对TGF-β1信号转导起着正向调节的作用，而Smad7则对TGF-β1信号转导起着负向调节的作用[18-19]。本研究结果显示：模型组大鼠肺组织p-ERK、Smad3蛋白水平较模型组升高，Smad7蛋白水平降低，而没食子酸组大鼠肺组织p-ERK、Smad3蛋白水平较模型组降低，Smad7蛋白表达较模型组升高，表明食子可能通过调节p-ERK、Smad3、Smad7的信号表达，从而减轻肺损伤。

综上所述，没食子酸可改善急性呼吸衰竭大鼠症状，减轻肺损伤，其机制可能与抑制炎症因子释放和调控肺组织p-ERK、Smad3、Smad7蛋白表达有关。