杨秋怡, 王琪, 马博
(天津中医药大学第一附属医院,天津 300193)
缺血性脑卒中(ischemic stroke)是常见的脑血管疾病,具有发病率高、致残率高、预后差、易复发等特点,现阶段不同年龄段人群中的发病率越来越高,但治疗脑卒中疾病的药物开发却稍显缓慢[1],因此,寻找和探索有效的脑卒中防治药物和方法具有重要的研究意义。缺血性脑卒中归属于中医学“中风病”范畴。本课题组前期应用具有滋阴活血通络功效的柔肝通络汤临床治疗缺血性脑卒中取得良好疗效,但其作用机制尚不明确。血管内皮生长因子(VEGF)家族是一类血管调节因子,在维护脑卒中神经血管单元稳态中发挥着关键作用[2-3]。因此,本研究构建缺血性脑卒中大鼠模型,采用柔肝通络汤进行干预,以VEGF为切入点,观察柔肝通络汤对缺血性脑卒中模型大鼠脑皮质血管再生、神经元损伤的影响,探讨柔肝通络汤的干预靶点,以期为其临床进一步应用治疗脑卒中提供理论依据,现将研究结果报道如下。
1.1实验动物选取SPF级健康雄性SD大鼠60只,4~6月龄,体质量140~250 g,广东省医学实验动物中心提供,生产许可证号:SCXK(粤)2022-0002,粤监证字2006A017。动物实验于天津医科大学动物实验中心[动物使用许可证号:SYXK(津)2020-00010]完成,室温15~20℃,湿度约为70%,每日12 h光照,喂养条件为自由摄取标准饲料,自由饮水。实验过程严格按照《实验动物管理条例》规定进行,实验方案已经我院实验动物伦理委员会审核批准。
1.2药物、试剂与仪器所有中药材由广东药科大学中医药研究院提供;阿司匹林片(四川新辉煌动物药业有限公司,批号:兽药字220771192);兔抗VEGF单克隆抗体、兔抗血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)单克隆抗体、兔抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)单克隆抗体,辣根过氧化酶标记抗兔IgG,血小板内皮细胞黏附分子1(CD31)(北京中杉金桥公司);末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡试剂盒(上海生物工程有限公司);蛋白定量试剂盒(美国Bio-Rad公司)。XSZ-5B切片机(重庆光学仪器厂);光学显微镜(桂林中辉科技发展有限公司);多功能酶标仪(美国BioTek公司)。
1.3柔肝通络汤制备柔肝通络汤组成:制首乌15 g、桑椹15 g、枸杞子30 g、丹参30 g、葛根30 g、当归尾10 g、赤芍10 g、地龙10 g、山楂15 g。一煎加水500 mL,煎汁150 mL,二煎加水300 mL,煎汁150 mL,取2次煎汁混合后文火煎制成膏状(含生药2 g/mL),冷藏备用。
1.4建模选取50只大鼠参照文献方法[4]采用Zea-Longa线栓法构建缺血性脑卒中模型。2%戊巴比妥钠麻醉注射后,使用3%恩氟烷混合70%N2O和30%O2维持麻醉,术中对大鼠右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉进行分离处理,使用尼龙缝合线从大鼠的颈外动脉侧端插入,由颈内动脉至距离颈外动脉和颈内动脉分叉口位置1.5 cm处停止该操作再穿入Willis环,阻断右侧大脑中动脉血供约1 h后将栓子拔出。术后控制大鼠体温在37℃左右。将大鼠尾部提起后左侧前肢表现为屈曲,则判断造模成功。
1.5分组与给药将造模成功的大鼠随机分为模型组、柔肝通络汤低剂量组、柔肝通络汤中剂量组、柔肝通络汤高剂量组、阿司匹林组,每组各10只。将剩余的10只大鼠设为正常组。柔肝通络汤低、中、高剂量组分别给予5.0、10.0、20.0 g/kg(相当于50.0 kg成人等效剂量的0.5、1、2倍)柔肝通络汤膏剂的生理盐水溶液灌胃,阿司匹林组给予20.0 mg/kg阿司匹林生理盐水混悬液灌胃,正常组与模型组给予生理盐水15.0 mL/kg灌胃。每日1次,连续14 d。
1.6观察指标与方法
1.6.1 Bederson法评定大鼠神经功能缺损情况 将大鼠尾巴提起并高于桌面部分,正常大鼠前爪伸向桌面,脑卒中大鼠对侧前肢屈曲。将大鼠放在利于爪子抓牢且有弹性的记录纸上,将其尾部提起并用手轻推大鼠肩部,直至前肢滑动几厘米为宜,并在不同方向重复,正常及轻度神经功能障碍大鼠会在不同方向以相同的力量抵抗推力。
评分标准[5]:神经功能健全为0分,前肢出现提尾悬空且不伴有其他不正常现象为1分,侧推抵抗力下降并伴前肢屈曲和无转圈行为2分,同2分行为并伴自发性旋转为3分。得分越高表示神经功能损伤越严重。
1.6.2 苏木素-伊红(HE)染色法观察脑组织病理变化 取脑去除嗅球及小脑部分后冷冻固定,石蜡包埋,冠状切片(厚度为4 μm)。脱水后进行苏木素、伊红染色,烘干后用中性树脂封片。显微镜下观察后拍照。
1.6.3 TUNEL法检测神经元凋亡 取脑皮质石蜡切片,脱蜡后按照说明书操作。显微镜下观察,TUNEL阳性细胞呈棕黄色或棕褐色颗粒。计算神经元凋亡指数:阳性细胞数/总细胞数×100%。
1.6.4 免疫组织化学法检测脑皮质CD31表达取脑皮质石蜡切片(厚度4 μm),常规二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化;加3%H2O2去离子水孵育10 min,阻断内源性过氧化物酶,PBS冲洗;加一抗CD31(1∶2 000稀释)37℃孵育1 h,PBS冲洗;加二抗(1∶2 000稀释)37℃孵育30 min,PBS冲洗;DAB显色,镜下观察染色,终止反应,清水冲洗5 min;苏木素淡染细胞核,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。显微镜下观察,每张切片随机选5个不重复的高倍镜视野,应用Motic Images Advanced软件进行分析,计算CD31阳性细胞(呈棕色颗粒)面积百分比。
1.6.5 Western Blot法检测脑皮质VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达 取脑皮质裂解、离心取上清,BCA蛋白定量法测定蛋白含量。取总蛋白20 μg,高温变性,加样,15%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白,浓缩胶所用电压为80 V 30 min,分离胶电压120 V 1 h,半干转膜(VEGF转膜40 min,VEGFR2转膜15 min,VEGFR1转膜15 min)。5%脱脂奶粉封闭1 h后,一抗VEGF(1∶1 000稀 释)、VEGFR1(1∶1 500稀释)、VEGFR2(1∶1 500稀释)、β-actin(1∶2 000稀释)4℃孵育过夜。次日,TBST液洗膜3次,每次10 min,用辣根过氧化物酶标记的IgG二抗(1∶5 000稀释)室温孵育2 h,TBST洗膜3次,10 min/次,超敏化学发光(ECL)试剂显色,曝光。最后应用ImageJ软件分析条带灰度值,结果以目的蛋白与内参蛋白灰度值比值表示。
1.7统计方法采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1各组大鼠神经功能损伤评分比较表1结果显示:与正常组比较,模型组大鼠出现神经功能明显损伤。治疗7、14 d后,与模型组比较,柔肝通络汤低、中、高剂量组和阿司匹林组大鼠神经功能损伤评分降低,其中,除柔肝通络汤低剂量组,其他各组差异均有统计学意义(P<0.05);而与阿司匹林组比较,柔肝通络汤高剂量组大鼠神经功能损伤评分降低(P<0.05)。给药14 d后,各治疗组大鼠神经功能损伤评分均低于给药7 d后,但差异均无统计学意义(P>0.05)。
表1 各组大鼠神经功能损伤评分比较Figure 1 Comparison of neurological impairment scores among various groups of rats (±s)
表1 各组大鼠神经功能损伤评分比较Figure 1 Comparison of neurological impairment scores among various groups of rats (±s)
注:①P<0.05,与正常组同时间点比较;②P<0.05,与模型组同时间点比较;③P<0.05,与阿司匹林组同时间点比较
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2.2各组大鼠脑组织病理形态比较图1结果显示:正常组大鼠脑组织结构无异常,细胞排列整齐,无水肿及坏死现象;模型组及柔肝通络汤低剂量组大鼠脑组织有坏死空洞、水肿形成,且组织结构紊乱、形态异常,炎症细胞浸润明显;柔肝通络汤中剂量组及阿司匹林组大鼠脑组织细胞肿胀现象较模型组有所减轻,炎症细胞浸润稍减轻,但仍伴有部分水肿现象;柔肝通络汤高剂量组大鼠脑组织病灶范围较模型组缩小,水肿明显减轻,炎症细胞浸润明显减少。
图1 各组大鼠脑组织HE染色结果(×400)Figure 1 HE staining results of brain tissue in various groups of rats(×400)
2.3各组大鼠神经元凋亡情况比较表2、图2结果显示:与正常组比较,模型组大鼠神经元凋亡指数升高(P<0.05);与模型组比较,柔肝通络汤低、中、高剂量组和阿司匹林组大鼠神经元凋亡指数降低,其中,除柔肝通络汤低剂量组,其他各组差异均有统计学意义(P<0.05);与阿司匹林组比较,柔肝通络汤高剂量组大鼠神经元凋亡指数降低(P<0.05)。
图2 各组大鼠神经元TUNEL染色结果Figure 2 Results of TUNEL staining of neurons in various groups of rats(×200)
表2 各组大鼠神经元凋亡指数比较Table 2 Comparison of neuronal apoptosis indices among various groups of rats (±s)
表2 各组大鼠神经元凋亡指数比较Table 2 Comparison of neuronal apoptosis indices among various groups of rats (±s)
注:①P<0.05,与正常组比较;②P<0.05,与模型组比较;③P<0.05,与阿司匹林组比较
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2.4各组大鼠脑皮质中CD31阳性表达比较表3、图3结果显示:与正常组比较,模型组大鼠脑皮质中CD31阳性表达水平升高(P<0.05);与模型组比较,柔肝通络汤低、中、高剂量组和阿司匹林组大鼠脑皮质中CD31阳性表达水平更高,其中,除柔肝通络汤低剂量组,其他各组差异均有统计学意义(P<0.05);与阿司匹林组比较,柔肝通络汤高剂量组大鼠脑皮质中CD31阳性表达水平升高(P<0.05)。
图3 各组大鼠脑皮质血小板内皮细胞黏附分子1(CD31)免疫组织化学结果Figure 3 Immunohistochemical results of CD31 in brain cortex of each group of rats(×200)
表3 各组大鼠脑皮质中血小板内皮细胞黏附分子1(CD31)阳性表达水平比较Table 3 Comparison of CD31 positive expression level in the cerebral cortex among various groups of rats(±s)
表3 各组大鼠脑皮质中血小板内皮细胞黏附分子1(CD31)阳性表达水平比较Table 3 Comparison of CD31 positive expression level in the cerebral cortex among various groups of rats(±s)
注:①P<0.05,与正常组比较;②P<0.05,与模型组比较;③P<0.05,与阿司匹林组比较
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2.5各组大鼠脑皮质中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达比较表4、图4结果显示:与正常组比较,模型组大鼠脑皮质中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达水平降低(P<0.05);与模型组比较,柔肝通络汤中、高剂量组和阿司匹林组大鼠脑皮质中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与阿司匹林组比较,柔肝通络汤高剂量组大鼠脑皮质中VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达水平均升高(P<0.05)。
图4 各组脑皮质血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)1、VEGFR2蛋白电泳图Figure 4 Electrophoretogram of VEGF,VEGFR1 and VEGFR2 proteins in cerebral cortex in various groups
表4 各组大鼠脑皮质中血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)1、VEGFR2蛋白表达比较Table 4 Comparison of protein expressions of VEGF,VEGFR1 and VEGFR2 in cerebral cortex among various groups of rats (±s)
表4 各组大鼠脑皮质中血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)1、VEGFR2蛋白表达比较Table 4 Comparison of protein expressions of VEGF,VEGFR1 and VEGFR2 in cerebral cortex among various groups of rats (±s)
注:①P<0.05,与正常组比较;②P<0.05,与模型组比较;③P<0.05,与阿司匹林组比较
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神经血管单元(neurovascular unit)概念的提出,为治疗缺血性脑卒中提供了新靶点,即应针对包括神经元、微循环及神经胶质在内的整体进行治疗,弥补以往单一针对神经元或血管治疗的局限性[6]。而中医药基于“整体观”特色理论可通过多层次、多靶点、多环节作用于相关调控基因的表达发挥脑保护的作用[7]。
脑卒中时因引起海马区神经元损伤可造成相关神经功能的损害[8]。脑皮质结构功能的破坏程度与神经元损伤程度具有相关性[9]。本研究结果显示,经柔肝通络汤干预后,缺血性脑卒中大鼠神经功能损伤评分降低,表明柔肝通络汤可改善缺血性脑卒中引起的神经功能受损,重塑神经功能。
当脑卒中发生时,脑内的神经元常表现为不可逆性坏死,且靠近核心区的半暗带内的神经元因能量代谢障碍通常以凋亡形式走向死亡[10-12]。因此,遏止坏死区域的扩大、挽救半暗带、抑制细胞凋亡是临床脑保护及脑治疗的主要靶点。脑卒中病灶边缘区域是神经元凋亡发生最多的区域,存有大量处于休眠或半休眠状态的可逆性神经元,若治疗及时,神经元可向正常组织进行转化,反之则会影响病情的发生发展[13]。本研究结果显示,柔肝通络汤组大鼠的脑神经元凋亡指数较模型组显著降低,表明柔肝通络汤可抑制神经元凋亡,发挥脑保护作用。
血小板内皮细胞黏附分子1(CD31)是主要存在于血管内皮细胞中的一种糖蛋白,可作为血管生成标志物,在脑损伤疾病中可用于评价微血管密度,反映血管新生情况[14]。本研究结果显示,柔肝通络汤组大鼠脑皮质中CD31阳性表达水平显著高于模型组,表明柔肝通络汤可促进缺血性脑卒中大鼠脑皮质血管再生。
相关研究表明,脑卒中发生时血管内皮生长因子(VEGF)及其相关受体在诱导基因、蛋白的表达和调节血管通透性、脑皮质血管再生以及神经元损伤中发挥了关键作用。VEGF被认为是最有效的促进血管新生因子,可与其相关因子结合,在促进血管内皮存活、调节细胞周期、增加血管通透性及促进血管新生等方面发挥重要作用[15-16]。VEGF对神经元的营养和保护发挥越来越重要的作用,VEGF与VEGFR1、VEGFR2结合可促进缺血脑组织神经元的生长和存活[17-18]。本研究结果显示,柔肝通络汤组大鼠脑皮质中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达水平较模型组升高,表明柔肝通络汤可上调缺血性脑卒中大鼠脑皮质VEGF及其受体的表达。
综上所述,柔肝通络汤可有效改善缺血性脑卒中大鼠脑组织病理学改变及神经功能损害,其机制可能与上调脑皮质VEGF及其受体的表达促进血管再生、抑制脑神经元凋亡有关。