植物精油与有机酸盐联合对曲霉菌的抑制作用

张桂枝，杨雪茹，陈旭勃，王 强，靳双星

(1.河南牧业经济学院，河南 郑州 450046；2.河南省家禽疾病防控工程技术研究中心，河南 郑州 450046；3.广州智龙生物科技有限公司，广东 广州 510032)

曲霉菌为自然环境中广泛存在的一种腐生真菌，主要包括烟曲霉菌、黄曲霉菌、土曲霉菌和黑曲霉菌等，其中烟曲霉菌和黄曲霉菌是常见的致病真菌，也是引发禽曲霉菌病的主要致病菌，对人畜也构成严重危害。植物精油对多种霉菌生长有显著的抑制作用，可有效地破坏霉菌的结构，减少霉菌毒素的产生。邬本成等[1]研究发现，由肉桂醛和香芹酚组成的复合精油能有效抑制饲料中青霉菌和黑曲霉菌的生长。冯文旭等[2]报道，丁香油、肉桂油、牛至油和山苍子油的纳米乳液均可有效抑制禾谷镰刀菌菌丝生长。双乙酸钠作为一种新型高效低毒的防霉剂，对黑曲霉、黄曲霉等多种霉菌的生长有显著抑制作用。靳双星等[3]研究发现，双乙酸钠与丁酸钠联合对黄曲霉菌的生长有协同增强作用。目前，关于植物精油与有机酸盐联合对曲霉菌生长的抑制作用报道较少。本试验选择对家禽危害最严重的两种曲霉菌—黄曲霉菌和烟曲霉菌为研究对象，探讨植物精油与有机酸盐联合对两种曲霉菌的抑菌效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

黄曲霉ATCC28539购于上海北思生物公司；烟曲霉CICC41022购于北京陆桥技术股份有限公司。

1.1.2 药品

PDA培养基购于北京奥博星生物技术有限公司；RPMI1640培养基购于南京建成生物工程研究所；双乙酸钠、丙酸钙、丁酸钠和山梨酸钾均购自河南省万家标准物质研发中心有限公司；肉桂醛和大蒜素由上海易恩化学技术有限公司提供；香芹酚、丁香酚、柠檬醛由Aladdin有限公司提供；百里香酚由天津市科密欧化学试剂有限公司提供；松油醇由天津市科密欧化学试剂有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 试验菌液的制备

取保存的黄曲霉和烟曲霉菌株接种于PDA培养基，28 ℃培养3天。待平板长满菌丝后，用含有0.1%吐温-80的无菌盐水冲洗，用巴氏吸管轻轻吹打使孢子游离出来。无菌纱布过滤去除菌丝，用pH 7.0的RPMI1640培养液重悬孢子，采用血细胞计数板计数，调整孢子液浓度为(2～5)×105cfu/mL。

1.2.2 抑菌圈直径的测定

用吐温-80作乳化剂，灭菌丙酮作溶剂，配制浓度为200 mg/mL的肉桂醛、柠檬醛、香芹酚、丁香酚、百里香酚、松油醇和大蒜素溶液。采用丝状真菌纸片扩散法进行药物敏感试验。取100 μL菌悬液均匀涂布于PDA培养基表面，夹取直径为6 mm的滤纸片贴于平板表面，吸取10 μL精油丙酮液滴于滤纸片表面，28 ℃培养48 h，测量抑菌圈直径，每个样品做三个重复。

1.2.3 最小抑菌浓度(MIC)测定

配制浓度均为256 mg/mL的肉桂醛、香芹酚、丁香酚和百里香酚溶液，配制方法同1.2.2，参照美国临床标准化委员会提出的M38-A2方案进行操作。在平底的96孔培养板上加样，同时设立阴性对照组(药物对照组)和无药阳性对照组。加样结束后，将培养板置于28 ℃培养72 h，观察真菌生长情况，同时在倒置显微镜下观察曲霉菌的孢子和菌丝。无真菌生长的最小药物浓度即为MIC。平行重复三次，若MIC值只差一个浓度梯度，取最高浓度。

1.2.4 最低杀菌浓度(MFC)测定

培养72 h后，从微量试验孔和无药阳性对照孔各吸取20 μL菌悬液倾注到PDA琼脂平板，28 ℃培养48 h后进行菌落计数，小于3 cfu/mL的最低药物浓度即为MFC。

1.2.5 联合抑菌试验

选出抑菌效果好的两种植物精油，按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1的比例联合，采用微量稀释法测定MIC，计数分级抑菌浓度指数(FIC)。平行重复三次，选出最佳复配比例。采用同样方法，测定复合植物精油和复合有机酸盐按照不同比例配合的MIC和FIC 。FIC≤0.5为增强作用；0.52为拮抗作用。

2 结果与分析

2.1 植物精油对曲霉菌的抑菌圈直径

由表1可知，7种植物精油对烟曲霉菌和黄曲霉菌抑菌效果有很大差异。肉桂醛对黄曲霉和烟曲霉菌抑菌圈直径分别为28.3 mm、20.1 mm，为高度敏感。丁香酚对黄曲霉菌抑菌圈直径为24.6 mm，为高度敏感，对烟曲霉菌中度敏感。香芹酚和百里香酚对黄曲霉和烟曲霉菌均为中度敏感。大蒜素、松油醇和柠檬醛对烟曲霉菌和黄曲霉菌的抑菌圈直径均小于10 mm。稀释液丙酮对烟曲霉菌和黄曲霉菌均无抑制作用。

表1 植物精油对黄、烟曲霉菌的抑菌圈直径 mm

2.2 MIC和MFC测定结果

由表2和图1、图2可知，8.0 mg/mL的肉桂醛能够完全杀灭黄曲霉菌和烟曲霉菌，在倒置显微镜下看不到菌丝和孢子；肉桂醛浓度为4.0 mg/mL时肉眼观察不到真菌生长，在倒置显微镜下只看到极少量的菌丝和孢子；随着肉桂醛浓度的降低，抑菌作用逐渐减弱，肉桂醛浓度为1.0 mg/mL时，在倒置显微镜下可看到多量的菌丝和孢子。丁香酚对黄曲霉菌和烟曲霉菌的MIC均为8.0 mg/mL，浓度为16.0 mg/mL的丁香酚完全杀灭黄曲霉菌和烟曲霉菌，在倒置显微镜下看不到菌丝和孢子。香芹酚和百里香酚对黄曲霉菌的MIC均为32.0 mg/mL，对烟曲霉菌的MIC均为16.0 mg/mL。

表2 4种植物精油对黄曲霉菌和烟曲霉菌的MIC、MFC mg/mL

图1 不同浓度肉桂醛对黄曲霉菌的抑菌效果

图2 不同浓度肉桂醛对烟曲霉菌的抑菌效果

2.3 植物精油联合对曲霉菌的抑菌效果

由表3和图3、图4可知，肉桂醛与丁香酚按照9种不同比例联合对黄曲霉菌和烟曲霉菌的FIC均小于1，二者联合表现出协同作用。肉桂醛与丁香酚按照质量比1∶2联合抑菌效果最佳，对黄曲霉菌和烟曲霉菌的MIC分别为2.0 mg/mL和1.0 mg/mL，FIC分别为0.33和0.17，MFC均为4.0 mg/mL。

表3 肉桂醛与丁香酚联合对黄曲霉菌、烟曲霉菌的MIC、MFC和FIC mg/mL

图3 不同浓度的1∶2复合植物精油对黄曲霉菌的抑菌效果

图4 不同浓度的1∶2复合植物精油对烟曲霉菌的抑菌效果

2.4 复合植物精油和复合有机酸盐联合对曲霉菌的抑菌效果

由表4和图5、图6可知，复合植物精油和复合有机酸盐按照9种不同比例联合对黄曲霉菌和烟曲霉菌的FIC均小于或等于2，二者联合表现出协同或无关作用。不同比例联合抑菌效果有很大差异，复合植物精油和复合有机酸盐按照1∶5、1∶4联合对黄曲霉菌和烟曲霉菌的MIC和FIC最小，抑菌效果最佳，为最佳复配组合。

表4 复合植物精油与复合有机酸盐对黄曲霉菌和烟曲霉菌的MIC、MFC和FIC mg/mL

图5 不同浓度的复合精油与复合有机酸盐对黄曲霉菌的抑菌效果

图6 不同浓度的复合精油与复合有机酸盐对烟曲霉菌的抑菌效果

3 讨论

3.1 植物精油对曲霉菌的抑制作用

植物精油的抗菌机理表现为破坏菌体细胞壁结构、增加菌体细胞膜的渗透性、影响菌体的物质和能量代谢、抑制菌体对营养物质的吸收利用以及抑制菌体DNA、RNA和蛋白质的生物合成等[4]。Sun等[5]研究发现，肉桂醛可以破坏黄曲霉菌丝体，并能下调黄曲霉毒素合成调控基因aflR的表达，抑制黄曲霉产生毒素。Liang等[6]发现，丁香酚通过下调黄曲霉毒素生物合成基因aflR、aflT、aflD、aflM和aflP来降低AFB1的产生。Ultee等[7]研究发现，香芹酚可引起真菌细胞膜扩张，导致离子泄漏从而发挥抗真菌作用。张文平[8]等研究报道，柠檬醛和肉桂醛抑制烟曲霉菌和黄曲霉菌DNA、RNA和蛋白质的合成，肉桂醛的抗曲霉菌效果优于柠檬醛。邬丽红等[9]研究发现，肉桂醛能够破坏烟曲霉菌的生物膜。孙琦[10]研究报道肉桂醛浓度为0.6 mmol/L时可显著抑制黄曲霉菌生长，对AFB1毒素的抑制率达70.8%。梁丹丹等[11]研究报道肉桂醛和丁香酚可有效抑制黄曲霉的生长及产毒。本试验表明，肉桂醛、柠檬醛、香芹酚、丁香酚、百里香酚、松油醇和大蒜素对烟曲霉菌和黄曲霉菌有不同程度的抑制作用，以肉桂醛对两种曲霉菌的抑菌效果最佳，MIC为4.0 mg/mL，肉桂醛浓度为8.0 mg/mL时能够完全杀灭黄曲霉菌和烟曲霉菌，在倒置显微镜下看不到其菌丝和孢子；其次是丁香酚，对黄曲霉菌和烟曲霉菌的MIC均为8.0 mg/mL；柠檬醛、松油醇和大蒜素对两种曲霉菌的抑菌效果欠佳。

3.2 植物精油联合的抗曲霉菌作用

不同植物精油之间合理配伍可产生协同抗菌作用。曲春阳等[12]研究报道，大蒜精油与肉桂精油按照体积比为1∶3联合对黄曲霉菌的抑菌效果优于单一植物精油。卢锟等[13]研究发现，肉桂精油与山苍子精油按体积比3∶1联合对黑曲霉和青霉有很好的抑制效果。本试验表明，肉桂醛与丁香酚按照9种不同比例联合对黄曲霉菌和烟曲霉菌的FIC均小于1，二者表现出协同作用，以肉桂醛、丁香酚1∶2联合抑菌效果最佳。肉桂醛与丁香酚联合产生协同抗菌作用的机制可能是二者结构不同。

3.3 植物精油与有机酸盐联合抗菌作用

张桂枝等[14]研究发现，牛至油和丁酸钠按照一定比例联合对大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌和链球菌的抑制效果优于单独牛至油，二者有协同增效作用。韩乾杰等[15]研究发现，肉桂醛与香兰素组成的复合植物精油和丁酸钠按照1∶1、1∶2、1∶3联合对大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌的抑制效果显著优于复合植物精油，丁酸钠能有效减少植物精油的用量。Cerisuelo等[16]研究发现，将低剂量的植物精油与丁酸钠混合，对抑制沙门氏菌生长有很好的抑制效果。萨仁高娃[17]研究报道，0.05%百里香精油与海藻酸盐复合涂膜处理可有效抑制鲜切瓜果上的大肠杆菌、霉菌和酵母菌的生长。本试验结果显示，由肉桂醛与丁香酚(W∶W=1∶2)组成的复合植物精油和由双乙酸钠与丁酸钠(W∶W=3∶1)组成的复合有机酸盐，按照1∶4或1∶5联合配伍对黄曲霉菌和烟曲霉菌有很好的协同抑菌效果，可以显著减少植物精油的用量。