HPLC法检测乙酰甲喹注射液中乙酰甲喹的含量

文英会，刘占通，王 丽，张莹莹

(1.河南牧业经济学院，河南 郑州 450046； 2.河南省兽药饲料监察所，河南 郑州 450008)

乙酰甲喹注射液是一种人工合成的化学类广谱抗菌制剂，属于喹噁啉类药物，又称痢菌净，对革兰氏阴性菌作用强，对鸡大肠杆菌病、仔猪黄白痢等均有效，在兽医临床中应用较广[1-4]。喹噁啉类药物在动物体内会有较大的毒性代谢物，对组织器官造成损害，因此，建立一种准确、稳定可靠的方法测定乙酰甲喹含量具有较为重要的意义[5,6]。

目前，测定乙酰甲喹注射液的含量主要采用非水滴定法[7]，但该方法操作步骤复杂繁琐，容易受到人为因素和环境的影响，且该方法的专属性不强，实验用到的试剂高氯酸和三氯甲烷等对人体危害较大，终点判断时由于颜色变化不明显，给结果判定带来一定困难[8,9]。本试验利用高效液相色谱法测定乙酰甲喹注射液的含量，该方法简便、准确，安全可靠，对操作人员及环境危害小，适用于乙酰甲喹注射液中乙酰甲喹含量的测定。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

1.1.1 试药及试剂

乙酰甲喹注射液(规格10 mL，0.2 g，批号20191001)由河南创鑫生物科技有限公司提供；乙酰甲喹对照品(100 mg，批号H11-01-20001含量100%)购自中国兽药品监察所；乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)，磷酸二氢钾(分析纯)，超纯水。

1.1.2 主要仪器

高效液相色谱(Waterse 2695,美国Waters公司)；紫外分光光度计(LAMBDA35，美国珀金埃尔默公司)；超纯水装置(Milli-Q Adbantage A10，美国Millipore公司)；酸度计(S210-KY1，瑞士梅特勒-托利多集团)；电子分析天平(AB204-N,瑞士梅特勒-托利多集团)；超声波清洗器(KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

对照品溶液的配制：精密称取乙酰甲喹对照品10 mg，置于100 mL量瓶中，加水稀释至0.1 mg/mL的标准品溶液，备用。

供试品溶液的配制：精密量取乙酰甲喹注射液1 mL至50 mL量瓶中，用水定容后，再从中取5 mL到100 mL量瓶中，稀释定容到刻度，摇匀，得到0.02 mg/mL的样品溶液，备用。

1.2.2 检测线波长的选择

精密量取0.1 mg/mL的对照品溶液10 mL置于100 mL量瓶中，加水稀释定容至刻度，摇匀后得到0.01 mg/mL的对照品溶液。用纯水做空白对照，稀释处理后的对照品溶液放入紫外分光光度计的1 cm石英吸收池中，在200～400 nm波长范围内进行光谱扫描。

1.2.3 色谱条件

色谱柱(Waters X-Bridge C18 150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温30 ℃，流动相(甲醇∶水=40∶60)，流速1.0 mL/min，检测波长为254 nm，进样量10 μL。

1.2.4 流动相的选择

根据乙酰甲喹的理化特性，分别选取甲醇和水(40∶60)、乙腈和水(13∶87)、磷酸二氢钾(1 g磷酸二氢钾加400 mL的水，用三乙胺调至pH=6.0)、乙腈(80∶20)、磷酸二氢钾(pH=4.7)和乙腈(80∶20)等四种流动相，按照1.2.3方法测定，记录色谱图。

1.2.5 标准曲线的建立

分别精密量取0.1 mg/mL的乙酰甲喹对照品溶液5 mL、10 mL、10 mL、5 mL对应放入100 mL、100 mL、50 mL、10 mL量瓶中，加水稀释定容，摇匀，稀释后分别以0.005 mg/mL、0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL的系列标准溶液，按照1.2.3方法测定，测定峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析。

1.2.6 重复性试验

精密量取1.2.1中配制好的供试品溶液，经过0.22 μm的滤膜后，重复进样6次，按照1.2.3方法测定，记录色谱图，计算相对标准偏差。

1.2.7 稳定性试验

精确量取乙酰甲喹对照品溶液1 mL，置于50 mL容量瓶中，用水稀释定容后，再从中取5 mL置于100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，经过0.22 μm滤膜，在室温下静置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h后测定乙酰甲喹的含量，按照1.2.3方法测定，进样量为10 μL，考察该试验方法的稳定性。

1.2.8 回收率试验

精密称取乙酰甲喹对照品25 mg于25 mL量瓶中，用水稀释定容至刻度后摇匀，做储备液备用。精密量取6份乙酰甲喹注射液0.5 mL置于50 mL量瓶中，再精密量取储备液8.5 mL于上述容量瓶中。用水稀释定容到刻度后摇匀，精密吸取5 mL到100 mL量瓶中用水稀释定容摇匀，经过0.22 μm滤膜后进样10 μL，按照1.2.3方法测定，对回收率进行考察。

2 结果

2.1 流动相的选择

分别选取甲醇∶水=40∶60、磷酸二氢钾(三乙胺调至pH=6.0)∶乙腈=80∶20、磷酸二氢钾(pH=4.7)∶乙腈=80∶20、乙腈∶水=13∶87四个流动相，用对照品溶液上机测定，查看分离效果。最终的测定结果表明，当流动相为甲醇∶水时，响应值大，理论塔板数高，系统适应性好，所以选取甲醇∶水(40∶60)为乙酰甲喹含量的流动相，结果见图1。

图1 乙酰甲喹对照品在不同流动相下的色谱图

2.2 检测波长的选择

乙酰甲喹对照品的紫外吸收光谱如图2所示，乙酰甲喹对照品一共有3个吸收峰，分别是241 nm、254 nm、371 nm，根据检测波长的选择原则(吸光度的最大值)，选取最大吸收峰值处254 nm作为检测乙酰甲喹注射液含量的波长。

图2 乙酰甲喹注射液紫外吸收光谱图

2.3 标准曲线的建立

以稀释后的对照品溶液浓度为横坐标，吸收峰面积为纵坐标，如图3所示，数据经分析处理后得线性回归方程为y=59346x-81849，相关系数R2=0.9983，证明在该色谱条件下，乙酰甲喹在0.005～0.1 mg/mL浓度范围内线性关系良好。

图3 乙酰甲喹对照品标准曲线

2.4 重复性试验

供试品溶液重复进样6次，峰面积分别为896333、900746、909908、909078、904603、897224，RSD为0.64%，表明该方法的重复性较好。

2.5 稳定性试验

室温下避光静置的乙酰甲喹对照品溶液在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h时上机进样10 μL，观察色谱图，计算其峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.13%，结果表明，该测定方法下的乙酰甲喹注射液在12 h内稳定性良好。

2.6 回收率试验

按照1.2.3方法测定结果如表1所示，样品的回收率为94.78%～96.67%，RSD为0.82%，表明该方法测定的乙酰甲喹准确度高。

表1 加样回收率

3 讨论

试验采用高效液相色谱法检测乙酰甲喹注射液中乙酰甲喹的含量。将对照品稀释处理后，经紫外分光光度计在200～400 nm波长范围内扫描以确定其最大吸收波长。紫外色谱图显示，在波长为254 nm时，乙酰甲喹对照品出现最大吸收峰，因此选定该波长为后续试验的检测波长。

配制三种不同的流动相，在色谱条件下检测，观察对照品色谱图。当流动相为甲醇∶水(40∶60)时，对照品响应值最大，理论塔板数最高为2031，出峰效果好。以甲醇∶水(40∶60)流动相、检测波长254 nm等为色谱条件，进行稳定性试验、线性回归分析、重复性试验和加样回收试验。结果表明该方法测定乙酰甲喹含量在12 h内稳定性良好，相对标准偏差(RSD)为0.14%；乙酰甲喹在0.005～0.1 mg/mL浓度范围内线性关系良好；重复性测定的相对标准偏差(RSD)为0.64%，精密度较高；加样回收率的相对标准偏差(RSD)为0.82%，准确度较高。

原标准规定的高氯酸滴定法，要求试验条件比较苛刻，滴定时必须在非水条件下进行。试验中需用三氯甲烷进行萃取，操作繁琐且该试剂毒性大；同时，萃取时间不同、力度不同，对试验结果均有一定的影响。弱碱性物质及盐类均可以与高氯酸反应，所以方法的专属性不高。在高氯酸滴定法检测过程中还发现，该方法对辅料要求非常严格。当使用辅料能溶于三氯甲烷而不易挥干时，影响含量测定的结果，无法滴定终点。本研究采用水为溶剂，不但减少了有毒试剂的使用，操作简便，专属性强，而且不受常用辅料的影响。本试验所建立的方法简便、准确可靠、重现性好。