重组鸡α干扰素生物学活性测定用细胞的筛选

王 翠，谢彩华，赵雪丽，王淑娟，柴 茂，马震原，杨海波，刘 影，王东方，闫若潜

(河南省动物疫病预防控制中心 河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室，河南 郑州 450008)

干扰素是一类动物机体产生的具有多重生物学功能的蛋白质。α干扰素属于细胞水平上的广谱的抗病毒、抗肿瘤细胞因子[1]，其主要通过抑制病毒增殖、增强抗肿瘤活性及加强NK细胞杀伤力从而发挥作用[2]，是一类具有临床应用价值的抗病毒制剂。重组鸡α干扰素(rChIFN-α)是鸡α干扰素和白细胞介素两种基因融合表达的蛋白，具有α干扰素和白细胞介素-2的双重生物学活性，适宜剂量rChIFN-α在鸡体内具有显著的抗病毒活性和免疫增强活性，是有应用潜力的基因工程抗病毒制剂[3]。

目前我国尚无rChIFN-α生物学活性测定的国家标准，《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》(2001版)《中国药典》均采用细胞病变抑制法测定干扰素的生物学活性[4,5]。本试验参照 “微量细胞病变抑制法”(简称CPE 抑制法)，采用鸡胚成纤维细胞(CEF)/水疱性口炎病毒(VSV)、鸡成纤维细胞系(DF-1)/水疱性口炎病毒(VSV)，测定三个批次rChIFN-α的生物学活性，比较CEF和DF-1两种细胞在rChIFN-α生物活性测定上的优劣。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

DMEM高糖培养基和D-Hanks缓冲液均为武汉博士德生物公司产品。胎牛血清为Sera Pro公司产品。胰蛋白酶-EDTA消化液和青链霉素混合液(100X)均为北京索莱宝科技有限公司产品。

1.1.2 主要仪器

二级生物安全柜为青岛海尔生物产品。INCUBATOR371二氧化碳培养箱为美国Thermo公司产品。TE2000倒置荧光显微镜为日本尼康公司产品。HH-ABS-2恒温水浴锅为上海跃进医疗器械厂产品。

1.1.3 细胞与毒株

DF-1购自武汉普诺赛生命科技有限公司。SPF鸡胚购自乾元浩(郑州)生物药厂。CEF由河南省动物疫病预防控制中心制备。VSV毒株由河南省动物疫病预防控制中心保存。rCHIFN-α(三个批号分别为202101、202102、202103)由河南省动物疫病预防控制中心制备与保存。

1.2 方法

1.2.1 CEF细胞的制备

9日龄SPF鸡胚经外壳消毒后，用镊子打开气室，取出鸡胚体，置于一次性无菌平皿中。剪去头、四肢和内脏后，鸡胚体用PBS洗涤2次，剪碎胚体，再用PBS洗涤2次。加入25 mL DMEM高糖培养基和5 mL胰蛋白酶-EDTA消化液，置于37 ℃细胞培养箱中消化20 min后，弃去培养基。加入40 mL DMEM高糖培养基(含有10%胎牛血清)，用吸管反复吹打数次,使细胞团块分散成为单个细胞，将分散均匀的单个细胞混合物加入到96孔细胞培养板中(100 μL/孔)，5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h。

1.2.2 DF-1细胞的传代培养

取培养至单层、长势良好的DF-1细胞，胰蛋白酶消化，然后用DMEM完全培养基(含有10%胎牛血清)重悬。按100 μL/孔的量加入到96孔细胞培养板中，置5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h至细胞长满单层，备用。

1.2.3 样品稀释与细胞混合

三个批次待检rChIFN-α样品由21至225进行连续2倍比系列稀释。待96孔培养板中的CEF和DF-1细胞长至铺满单层，用D-Hanks液洗涤细胞两次，将上述稀释好的待检样品依次分别加入到CEF和DF-1细胞中，每个稀释度重复四孔。同时设置细胞对照组。置37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h左右。

1.2.4 加入VSV病毒

24 h后，以100 TCID50/mL的浓度加入VSV病毒，100 μL/孔。同时设置病毒对照组。置37 ℃、5% CO2培养箱培养24-36 h。

1.2.5 观察结果

加入VSV病毒24-36 h后，电子显微镜下观察细胞形态，若对照组中各孔细胞的形态和生长良好，而病毒对照组中各孔细胞形态出现皱缩、变圆、破碎、脱落，有75%～100%细胞出现明显的病变和死亡，则说明试验设置的对照系统成立，试验结果可信。

1.2.6 生物学活性单位计算

按照Reed-Muench法计算生物学活性单位，计算公式为：

距离比=(高于50%的百分数-50)/(高于50%的百分数-低分50%百分数)

=(80-50)/(80-20)=30/60=0.5

此批次rChIFN-α待检样品稀释到217.5时能保护半数细胞免受VSV病毒攻击损害，该批次rChIFN-α样品的效价即为185364单位(以IU表示)。

2 结果

2.1 显微镜下观察结果

将三个批次的rChIFN-α细胞病变孔数与细胞病变程度进行比较，CEF和DF-1细胞对照组正常，病毒对照组出现典型病变(图1和图2)。

A:细胞对照组；B：病毒对照组； C：2.10×107 IU /mL 重组鸡α干扰素抗VSV孔；D：4.19×107IU /mL 重组鸡α干扰素抗VSV孔

A:细胞对照组；B：病毒对照组； C：2.10×107 IU /mL 重组鸡α干扰素抗VSV孔；D：4.19×107IU /mL 重组鸡α干扰素抗VSV孔

2.2 结果计算

2.2.1 rChIFN-α在CEF细胞上的生物学活性

三个批次rChIFN-α能抑制50%细胞病变的干扰素稀释度的对数(log2X)均为22，即rChIFN-α(0.1 mL)稀释到222时能保护半数细胞免受损害，计算X=4.19×107IU/mL，即rChIFN-α的效价为4.19×107IU/mL(表1)。相同试验条件下，细胞对照组各孔细胞状态和长势良好，病毒对照组各孔细胞均出现病变。

表1 重组鸡α干扰素在CEF细胞上生物学活性

2.2.2 rChIFN-α在DF-1细胞上生物学活性

三个批次rChIFN-α能抑制50%细胞病变的干扰素稀释度的对数(log2X)分别为22、22、21，即rChIFN-α(0.1 mL)稀释到222和221时能保护半数细胞免受损害，计算X=4.19×107IU/mL、X=4.19×107IU/mL、X=2.10×107IU/mL，即rChIFN-α的效价为4.19×107IU/mL、4.19×107IU/mL、2.10×107IU/mL(表2)。

相同试验条件下细胞对照组各孔细胞状态和长势良好，病毒对照组各孔细胞均出现病变。高浓度的rChIFN-α会导致CEF和DF-1细胞死亡，表明rChIFN-α在CEF和DF-1两种细胞上存在最适抗VSV活性作用浓度，并非浓度越高抗VSV活性越好。

表2 重组鸡α干扰素在DF-1细胞上生物学活性测定

续表2 重组鸡α干扰素在DF-1细胞上生物学活性测定

3 结论

rChIFN-α在CEF和DF-1上生物学活性效价分别为4.19×107IU/mL、4.19×107IU/mL、4.19×107IU/mL和4.19×107IU/mL、4.19×107IU/mL、2.10×107IU/mL。鉴于CEF制备繁琐、成本较高，而DF-1可大量增殖、传代培养，且培养便捷，因此，DF-1比CEF更适合于rChIFN-α生物学活性的测定。