舒诺颗粒质量控制研究

田 元，屈小娟，刘建书，刘玉凤，赵玉珍，陈丽英，韩晓玲*

(1.西安力邦制药有限公司，陕西 西安 710000；2.陕西功能食品工程中心有限公司，陕西 西安 710003；3.杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100)

随着社会经济的发展及人民饮食结构的改变，高血糖、高血压、高血脂等疾病发病率日益上升。在医学上，当空腹血糖≥7 mmol/L时可判定为糖尿病[1]。目前，全球4位糖尿病患者中，中国患者即占1人，中国成人糖尿病患病率居世界第1位[2-3]，糖尿病及其并发症严重危害着国民生命健康。

基于此，西安力邦制药有限公司联合陕西功能食品工程中心有限公司，依据中医糖尿病发病理论，合作开发了舒诺颗粒保健食品，该产品以一定量的玉米须、枸杞子、葛根、生地黄、黄芪、五味子、西洋参、富铬酵母及其他辅料加工制成。经功能试验证明该产品能降血糖，可起到辅助预防和治疗糖尿病的作用。

舒诺颗粒配方中：①黄芪[4-7]：可增加胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，抑制脑干神经元的细胞凋亡，显著改善高血糖和氧化应激引起的中枢神经损伤；还可以防治糖尿病视网膜、心脑血管和肾脏病变等并发症；②西洋参[8-9]：通过保护和恢复胰岛β细胞，增加胰岛素敏感性等多种方式，促进胰岛素分泌；③枸杞子[10]：可保护胰岛功能，改善胰岛素抵抗，预防及控制糖尿病并发症发生。此外，因产品中含葛根素、粗多糖、皂苷等多种生理活性物质，这些成分协同作用，具有辅助降血糖的功能。

因此，本研究对舒诺颗粒中黄芪、西洋参、枸杞子进行定性鉴别，将葛根素、粗多糖、皂苷作为该产品的功效成分，采用薄层色谱法(TLC)鉴定黄芪、西洋参、枸杞子，高效液相色谱法(HPLC)测定葛根素含量，紫外可见分光光度法测定粗多糖、总皂苷含量，并制定葛根素、粗多糖、总皂苷的含量限度，以期为舒诺颗粒质量控制提供依据。

1 材料

1.1 药品与试剂

舒诺颗粒(陕西功能食品工程中心有限公司生产，批号：20171001、20171002、20171003，规格：6 g/袋)；舒诺颗粒阴性样品(分别缺少黄芪、西洋参、枸杞子，按舒诺颗粒制备工艺自制)；糖化酶(上海惠诚生物科技有限公司)；人参皂苷Rb1(批号：110704-201726，纯度91.1%)、人参皂苷Re(批号：110754-201626，纯度97.4%)、人参皂苷Rg1(批号：110703-201731，纯度93.6%)、拟人参皂苷F11(批号：110841-201607)、西洋参对照药材(批号：120997-201309)、黄芪甲苷对照品(批号：110781-201717，纯度：96.9%)、枸杞子对照药材(批号：121072-201611)、葛根素(批号：110752-201615，纯度95.4%)、D-葡萄糖对照品(批号：110833-201707，纯度99.9%)购自中国食品药品检定研究院；硅胶G254薄层色谱板、硅胶G薄层色谱板均购自青岛圣浦林环保科技有限公司；实验用水为超纯水，甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.2 仪器

离心机(德国sigma 型号：3-30KS)；高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司 型号：Agilent 1260)；电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司 型号：BSA224S)；数显水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司 型号：HH4)；超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司 型号：KQ3200E)；紫外分析光度计(上海光谱仪器有限公司 型号：SP-756P)。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱法

2.1.1 黄芪鉴别 (1)样品溶液制备。黄芪甲苷对照品溶液[11]：以甲醇为溶剂，制成黄芪甲苷浓度为1 mg/mL的溶液。

黄芪药材溶液[11]：按照2015年版《中国药典》一部黄芪鉴别中规定方法制备。

舒诺颗粒供试品溶液、舒诺颗粒阴性对照液(缺黄芪)[11-12]：按照2015版《中国药典》一部黄芪鉴别中规定方法制备供试品溶液及阴性对照溶液，过D101型大孔树脂柱(内径1.2 cm，柱高15 cm)，分别用水50 mL、35% 乙醇50 mL、70% 乙醇80 mL洗脱，收集70% 乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.1 mL溶解，得舒诺颗粒供试品溶液、舒诺颗粒阴性对照液(缺黄芪)。

(2)鉴别方法[11]。按照2015年版《中国药典》一部中黄芪薄层色谱法规定鉴别。见图1。

注：1.黄芪甲苷；2.黄芪药材；3.20171001号样品；4.20171002号样品；5.20171003号样品；6.阴性对照。

由图1可知，在薄层色谱中，舒诺颗粒供试品与黄芪甲苷对照品、黄芪对照药材图谱相应位置、荧光斑点逐一对应，清晰可见，且阴性对照无干扰，表明该法具有专一性，可用于舒诺颗粒中黄芪鉴别。

2.1.2 西洋参鉴别 (1)样品溶液制备。混合对照品溶液、西洋参对照药材溶液、西洋参药材溶液[13]：按照2020年版《中国药典》一部西洋参鉴别中规定方法制备。

舒诺颗粒供试品溶液、舒诺颗粒阴性对照溶液(缺西洋参)[13-14]：按照2020年版《中国药典》一部西洋参鉴别中规定方法制备供试品溶液及阴性对照溶液，上D101型大孔吸附树脂柱(内径12 mm，柱高15 cm)，以水50 mL洗脱，弃水液，用35% 乙醇50 mL洗脱，弃洗脱液，继用70% 乙醇 80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5 mL溶解，得舒诺颗粒供试品溶液、舒诺颗粒阴性对照溶液(缺西洋参)。

(2)鉴别方法。除以三氯甲烷-甲醇-水(31∶14∶5)5～10 ℃ 放置12 h的下层溶液为展开剂外，其余步骤按照2020版《中国药典》四部中薄层色谱法(通则0502)试验规定进行。见图2。

注：1.混合对照；2.西洋参对照药材；3.西洋参药材；4.20171001号样品；5.20171002号样品；6.20171003号样品；7.阴性对照。

由图2可知，在薄层色谱中，供试品与混合对照品、西洋参对照药材、西洋参药材图谱相应位置、荧光斑点逐一对应，清晰可见，表明该法具有专一性，可用于舒诺颗粒中西洋参鉴别。

2.1.3 枸杞子鉴别 (1)样品溶液制备。枸杞子对照药材溶液、枸杞子药材溶液[13]：按照2020版《中国药典》一部枸杞子鉴别中规定方法制备。

舒诺颗粒供试品溶液、舒诺颗粒阴性对照溶液(缺枸杞子)[13]：取样1.5 g研制成粉末，加水70 mL，其余步骤按照2020版《中国药典》一部枸杞子鉴别中规定方法制备。

(2)鉴别方法。按照2020版《中国药典》四部中薄层色谱法(通则0502)[13]试验规定进行。见图3。

注：1.枸杞子对照药材；2.枸杞子药材；3.20171001号样品；4.20171002号样品；5.20171003号样品；6.阴性对照。

由图3可知，在薄层色谱中，供试品与枸杞子对照药材、枸杞子药材图谱相应位置、荧光斑点逐一对应，清晰可见，表明该法具有专一性，可用于舒诺颗粒中枸杞子鉴别。

2.2 高效液相色谱法

2.2.1 葛根素含量测定 (1)样品溶液制备。标准储备液：精密称取葛根素对照品8.14 mg，用30% 乙醇于100 mL量瓶中溶解定容，得每1 mL含77.66 μg葛根素的标准储备液。

供试品溶液[15]：精密称取舒诺颗粒0.3 g于具塞锥形瓶中，加入30%的乙醇50 mL，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用30%的乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

(2)色谱条件与系统适应性试验。分别取标准储备液和供试样溶液按照色谱条件：色谱柱：C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(25∶75)；流速：1 mL/min；波长：250 nm，进样量10 μL，记录图谱。见图4。

由图4可知，在此色谱条件下，对照品和供试品溶液中被测组分均可达到基线分离，且峰型对称、分离度好。

(3)方法学考察。线性关系考察：分别取标准储备液1 mL、2 mL、3 mL、5 mL、7 mL于10 mL量瓶中，用 30% 乙醇定容。按“2.2.1(2)”色谱条件测定，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求回归方程。得葛根素的标准曲线方程为：y=47 597x+33 785(r=0.999 8)，结果表明，葛根素在7.766～54.362 μg/mL质量浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。

图4 葛根素对照品(A)、舒诺颗粒样品(B)HPLC色谱

检出限试验：以信噪比3∶1相应浓度为检出限，测定葛根素的检出限。结果得出，葛根素的检出限为2.33 mg/100 g。

精密度试验：分别取线性测定中的标3溶液和供试品溶液，各重复进样6次，记录峰面积。结果显示，葛根素面积的RSD分别为0.01%(n=6)、0.35%(n=6)，表明仪器精密度良好。

重复性试验：按照“2.2.1(2)”的色谱条件测定同一批次舒诺颗粒样品中葛根素含量，平行测定6份，记录峰面积。结果显示，葛根素平均含量为0.313 6 g/100 g，RSD为0.31%(n=6)，表明该方法重复性较好。

稳定性试验：按照“2.2.1(2)”的色谱条件，分别在相对0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h时测定同一批次舒诺颗粒样品中葛根素含量，记录峰面积。结果显示，葛根素峰面积的RSD=0.81%，表明室温条件下供试品在24 h内稳定。

加标回收率试验：取已知含量舒诺颗粒(批号：20171001，葛根素含量为0.313 6 g/100 g)0.15 g，各9份，置具塞锥形瓶，分为3组，每组分别加入浓度为77.66 μg/mL的葛根素标准储备液3 mL、6 mL、9 mL，按照“2.2.1(2)”的色谱条件测定，记录峰面积，计算加标回收率。见表1。

表1 葛根素回收率试验结果

由表1可知，葛根素的平均加样回收率为101.92%，RSD为2.56%(n=9)，该方法可用于舒诺颗粒中葛根素含量测定。

2.2.2 样品中葛根素含量测定 按照“2.2.1(1)”项下供试溶液的制备方法，制备3批次(20171001、20171002、20171003)舒诺颗粒供试液各2份，按照“2.2.1(2)”的色谱条件测定，记录峰面积并计算葛根素含量。见表2。

由表2计算可得，3批次舒诺颗粒平均葛根素含量为：0.304 9 g/100 g，按平均含量的90%设限，规定葛根素含量不低于0.27%。

表2 葛根素含量测定结果

2.3 紫外可见分光光度法

2.3.1 粗多糖测定 (1)样品溶液制备：标准储备液：称取无水葡萄糖对照品10.01 mg，置10 mL量瓶中，加适量水溶解，稀释至刻度，摇匀，即得每mL含1.00 mg无水葡萄糖标准储备液。

供试品溶液：精密称取舒诺颗粒1.6 g，加乙醚100 mL，40 ℃加热回流1 h，静置冷却，弃乙醚液，残渣水浴挥尽乙醚。加80% 乙醇100 mL，80 ℃加热回流1 h，过滤，滤渣与滤器用80%热乙醇多次洗涤，滤渣及滤器置烧瓶中，加水150 mL，100 ℃加热回流2 h。趁热滤过，用少量热水洗涤滤器，合并滤液和洗液。添加30 mg糖化酶于60 ℃、pH=4.5条件下酶解2 h，电炉上加热至沸，冷却，过滤，取滤液定容至150 mL。取滤液30 mL，置于250 mL锥形瓶，再加入200 mL无水乙醇，混匀，于4 ℃冰箱静置4 h以上，以6 000 r/min离心15 min，弃上清液，残渣用水溶解并定容至50 mL，得供试品溶液。

(2)测定方法：①绘制标准曲线：精密量取1 mL标准储备液于10 mL量瓶中，用水定容至刻度，得到含葡萄糖0.10 mg/mL标准溶液。精密量取标准溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL分别置于10 mL的具塞试管中，加水补至2.0 mL，摇匀，精密加入1 mL 5%苯酚溶液，摇匀，迅速精密加入5 mL硫酸，摇匀，放置10 min，100 ℃水浴2 min，取出，迅速冷却至室温，以相应的试剂为空白，在485 nm处测定吸光度，重复3次，以吸光度值(A)为纵坐标，葡萄糖的浓度(μg/mL)为横坐标，进行线性回归。

②含量测定：准确取供试品溶液1 mL于10 mL具塞试管，按照“2.3.1(2)①”步骤测定吸光度并计算粗多糖含量。

(3)方法学考察：线性范围考察：按照“2.3.1(2)”方法绘制标准曲线，得曲线方程为：A=0.046 6×C+0.006 8(r=0.999 6)，结果表明，葡萄糖在0～15.00 μg/mL呈良好线性关系。

检出限测定：以20次空白测定值的3倍标准偏差除以标准曲线之斜率(即D.L.=3SD/S)计算，可得粗多糖的检出限。结果得出，粗多糖的检出限为0.04 mg/100 g。

精密度试验：取葡萄糖标准溶液(0.10 mg/mL)0.6 mL，加水补至2 mL，依法测定吸光度值，结果表明葡萄糖吸光度的RSD为0.10%(n=6)，仪器精密度良好。

重复性试验：取20171001批次舒诺颗粒1.6 g，共6份，按“2.3.1(1)”方法制备供试品溶液，依法测定，测量并计算粗多糖平均含量。测得粗多糖平均含量为0.968 2 g/100 g，RSD为1.010 9%，结果表明，该方法重复性较好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h时依法测定吸光度，可得各时间样品吸光度的RSD=1.25%，表明室温条件下供试品在24 h内稳定。

加标回收率试验：取20171001批号舒诺颗粒(粗多糖含量为0.968 2 g/100 g)0.8 g，各9份，分3组，每组分别加入浓度为1.00 mg/mL的葡萄糖标准贮备液4 mL、8 mL、12 mL，按“2.3.1(1)”项下方法制备供试品溶液，依法测定，记录吸光度，并计算加标回收率。见表3。

表3 回收率试验结果

由表3可知，粗多糖的平均加样回收率为98.27%，RSD为1.22%(n=9)，该方法可用于舒诺颗粒中粗多糖含量测定。

(4)样品中粗多糖含量测定。分别测定不同生产批号的3批样品，计算粗多糖含量。见表4。

由表4计算可得，3批次舒诺颗粒平均粗多糖含量为：0.966 g/100 g，按平均含量的90%设限，规定粗多糖含量不低于0.87%。

2.3.2 总皂苷测定 (1)样品溶液制备：标准贮备液[16]：取人参皂苷标准品0.024 2 g，用甲醇溶解定容至10 mL，制成2.36 mg/mL的人参皂苷Re标准液。

表4 粗多糖含量测定结果

供试品溶液[16]：称取舒诺颗粒1 g，置于25 mL量瓶中，加适量水超声30 min，再用水定容至25 mL，摇匀，放置，滤过。吸取上清液1.0 mL进行柱层析。柱层析方法按照2020年版《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则》中总皂苷测定方法进行。

(2)测定方法：标准曲线绘制：精密吸取标准贮备液20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL于蒸发皿中水浴挥干(低于60 ℃)，在已挥干的蒸发皿中准确加入0.2 mL 5% 香草醛冰乙酸溶液，转动蒸发皿，使残渣溶解，加0.8 mL高氯酸，混匀后移入10 mL带塞刻度离心管中，60 ℃水浴10 min，取出，冰浴冷却后，准确加入冰乙酸5.0 mL摇匀，以1 cm比色池于560 nm波长处与标准管共同进行比色测定。以吸光度为纵坐标，人参皂苷Re浓度(μg/mL)为横坐标，进行线性回归。

含量测定：准确移取供试品溶液1 mL于10 mL具塞试管，按照“2.3.2(2)”步骤测定吸光度值并计算总皂苷含量。

(3)方法学考察：线性范围考察：按照“2.3.2(2)”方法绘制标准曲线，得回归方程为：y=240.84x-9.6157(R2=0.999 1)，结果表明，人参皂苷Re在47.20～283.20 μg/mL内呈良好线性。

检出限测定：以20次空白测定值的3倍标准偏差除以标准曲线之斜率(即D.L.=3SD/S)计算，可得总皂苷的检出限。结果得出，总皂苷的检出限为0.17 mg/100 g，检出限越低，灵敏越度高。

精密度试验：取人参皂苷标准溶液(2.36 mg/mL)60 μL，依法测定吸光度值，结果人参皂苷Re吸光度的RSD为0.324 8%(n=6)，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取20171001批次舒诺颗粒1 g，共6份，按“2.3.2(1)”项下方法制备供试品溶液，依法测定，测得总皂苷(以人参皂苷Re计)平均含量为0.324 7 g/100 g，RSD为1.85%，表明该方法重复性较好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h时依法测定吸光度，可得各时间样品吸光度的RSD=1.97%，表明室温条件下供试品在24 h内稳定。

加标回收率试验：取20171001批号舒诺颗粒(总皂苷(以人参皂苷Re计)含量为0.324 7 g/100 g)0.5 g，各9份，置100 mL量瓶中，分为3组，分别精密加入人参皂苷Re标准贮备液(2.36 mg/mL)0.4、0.8、1.2 mL，依法测定吸光度，并计算加标回收率。见表5。

表5 回收率试验结果

由表5可知，总皂苷的平均加样回收率为99.02%，RSD为1.63%(n=9)，该方法可用于舒诺颗粒中总皂苷含量测定。

(4)样品中总皂苷含量测定。按正文分析方法分别测定不同生产批号的3批样品，计算含量。见表6。

由表6计算可得，3批次舒诺颗粒平均总皂苷含量为：0.320 3 g/100 g，按平均含量的90%设限，规定总皂苷含量不低于0.28%。

3 讨论

尽管单成分鉴定、含量测定易于实现，但在复方制剂中，由于受多种因素干扰，因而成分鉴别、含量检测方法需根据实际情况调整。

表6 总皂苷含量测定结果

3.1 薄层色谱

采用《中国药典》方法对黄芪和西洋参进行薄层鉴别试验时，供试品色谱背景较重，斑点较淡，本研究遂对方法进行了调整。

(1)黄芪薄层色谱鉴别。与《中国药典》鉴定方法相比，增加了供试样品溶液大孔吸附树脂分离纯化步骤，其中70%乙醇洗脱，结果薄层试验条带背景较浅，薄层结果斑点清晰，分离度好。

(2)西洋参薄层色谱鉴别。与《中国药典》鉴定方法相比，增加了供试样品溶液大孔吸附树脂分离纯化步骤，并以三氯甲烷-甲醇-水(31∶14∶5) 5～10 ℃放置12 h的下层溶液为展开剂，得到的薄层色谱斑点清晰、分离好，且各特征成分Rf值适宜，阴性对照无干扰。

3.2 紫外分光光度计

本研究粗多糖含量测定与保健食品中粗多糖含量测定方法比较，增加了糖化酶水解糊精步骤。最终结果表明，当糖化酶添加量为30 mg，酶解时间2 h时，糊精酶解完全，去除了干扰，确保了检测结果的准确性。

4 结论

本研究建立了舒诺颗粒中黄芪、西洋参、枸杞子的鉴定方法，以及葛根素、粗多糖、总皂苷的含量测定方法，并规定葛根素含量不低于0.27%，粗多糖含量不低于0.87%，总皂苷含量不低于0.28%，为该产品的质量控制提供了可靠的依据。