超声波酶法辅助提取紫萁黄酮工艺及抗氧化活性研究

李克香，向建英，唐军荣，邱旭，阚欢，，刘云，

(1. 西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650224；

2. 西南林业大学西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南 昆明 650224；3. 云南省高校大健康类森林资源开发利用工程研究中心，云南 昆明 650224)

紫萁(Osmunda japonica)为紫萁属多年生草本蕨类植物[1]，别名薇菜、高脚贯众、猫儿蕨等，生于林下或溪边酸性土上，北起山东，南达两广，东自海边，西达云、贵、川西，北至秦岭南坡均有分布，素有绿色保健食品之称，可药食两用[2]，以“山菜之王”和“山珍”闻名中外[3]。紫萁幼叶作为蔬菜食用在我国已有3 000 多年的历史，加工成紫萁干后，长期出口到日本、韩国及东南亚等国家[4]。紫萁含有黄酮类[5]、 内酯类[6]、 多糖类[7－9]、鞣质[10]及氨基酸类[11]等多种活性成分，其中黄酮类化合物是紫萁资源中的重要活性成分之一。

紫萁黄酮具有抗衰老、抗肿瘤、抑菌、提高机体免疫力等生理活性功能[12－14]，提取方法主要有乙醇提取法[15]、丙酮提取法[16]、微波辅助提取法等[17]。植物中的黄酮类化合物通常以糖苷或其它共轭体的形式存在液泡中[18]。植物细胞壁主要由纤维素组成，紫萁中的纤维素含量高达37.4%[19]。纤维素酶能水解植物细胞中的纤维素β－D－葡萄糖苷键，破坏植物细胞壁，有助于黄酮成分的充分溶出。超声波产生的空化效应、机械效应及振荡作用，能够破坏植物组织，加速黄酮成分的溶出[20]。超声波酶辅助提取法具有安全、环保、效率高等优点[21]，此法在提取紫萁黄酮中的研究至今未见报道。本研究以云南野生紫萁为原料，采用响应面分析优化超声波酶辅助提取紫萁黄酮的工艺[22]，并对其进行抗氧化活性评价，以期为紫萁的综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生紫萁材料采自云南迪庆。将采集的新鲜紫萁于50℃恒温干燥后，粉碎过80 目筛，得到的紫萁粉于4℃冰箱内保存备用。

芦丁标准品(≥98%)、纤维素酶(50 U/mg)、2，2′－联氮－双－3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸(ABTS):上海源叶生物科技有限公司；1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH):北京博奥拓达科技有限公司；维生素C(VC):广东光华科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

UV－2600 紫外可见分光光度计:岛津仪器(苏州)有限公司；SB25－12DTDS 超声波清洗机:宁波新艺超声设备有限公司；DK－98－Ⅱ电热恒温水浴锅:天津市泰斯特仪器有限公司；Spectra-Max190 酶标仪:美谷分子仪器(上海)有限公司；FD5－3 冷冻干燥机:金西盟(北京)仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 紫萁黄酮的提取 准确称取适量紫萁粉末于离心管中，按一定液料比加入不同浓度的乙醇溶液，混匀后调节pH 为5，采用纤维素酶在50℃水浴中对样品进行酶解，酶解后将酶灭活，然后将灭活后混合溶液在50℃下进行超声提取，离心取上清液，即为紫萁黄酮提取液。

1.3.2 建立芦丁标准曲线 参考李欣燃等[23]的方法，稍加改动。准确称取10 mg 芦丁标准品，用50%乙醇定容至100 mL，配成浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准液，之后吸取0、2、4、6、8、10、12 mL，分别置于25 mL 刻度试管中，依次加入5%亚硝酸钠1 mL、10%硝酸铝溶液1 mL 、5%氢氧化钠溶液10 mL，最后用50%乙醇定容、静置15 min，用50%的乙醇作为空白对照，于510 nm 处测定吸光值。以吸光值为纵坐标(A)、芦丁质量浓度为横坐标(C，mg/mL)绘制标准曲线，并拟合得到回归方程为A＝11.2664C＋0.0007(R2＝0.9994)。

1.3.3 紫萁黄酮的得率测定 将1.3.1 中所得紫萁黄酮提取液定容至25 mL，取1 mL 按1.3.2 中建立标准曲线的方法测定，根据公式(1)计算紫萁黄酮得率:

式中:c 为紫萁黄酮质量浓度，mg/mL；N 为稀释倍数；v 为待测提取液的总体积，mL；m 为紫萁粉样品质量，g。

1.3.4 紫萁黄酮提取单因素试验 在1.3.1 的基础上，分别考察超声时间(10、20、30、40、50 min)、纤维素酶添加量(0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%)、液料比(10、20、30、40、50 mL/g)、乙醇浓度(30%、40%、50%、60%、70%)、纤维素酶解时间(10、25、40、55、70 min)、超声功率(100、200、300、400、500 W)对紫萁黄酮得率的影响。

1.3.5 紫萁黄酮提取响应面优化试验 用SPSS 26 软件分析单因素试验结果，选取4 个对紫萁黄酮得率影响显著的因素作为自变量，以紫萁黄酮得率(Y)为响应值，进行Box－Behnken 响应面设计，优化紫萁黄酮的提取工艺条件[24]。响应面试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计

1.3.6 紫萁黄酮抗氧化活性测定 DPPH 自由基清除能力测定:参照袁燕等[25]的方法并稍加改动。将紫萁黄酮粗提液冻干后，用蒸馏水复溶，配制浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 的紫萁黄酮样品溶液，之后分别取3 mL 于10 mL 离心管中，加入3 mL 浓度为0.08 mg/mL 的DPPH－无水乙醇溶液混匀，避光30 min 后，取200 μL 混合液于96 孔酶标板中，在酶标仪517 nm 处测定吸光值。同时设定空白组和样品对照组，每组试验重复3 次。配制浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL 的VC 溶液作为对照。根据公式(2)计算清除率。

式中:A0为DPPH 自由基和无水乙醇的吸光值；A1为紫萁黄酮提取液和DPPH 自由基的吸光值；A2为紫萁黄酮提取液和无水乙醇的吸光值。

ABTS 自由基清除能力测定:参照李伟等[26]的方法并稍加改动。将7 mmol/mL ABTS 溶液5 mL 与140 mmol/mL 过硫酸钾水溶液88 μL 混合均匀并避光反应12 h，得到ABTS＋·储备液；使用前用蒸馏水稀释ABTS＋·储备液使其734 nm 处吸光值为0.70±0.02，即得ABTS＋·工作液，现配现用。将紫萁黄酮粗提液冻干后，用蒸馏水复溶，配制浓度为0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 mg/mL 的紫萁黄酮样品溶液。移取不同浓度紫萁黄酮样品溶液50 μL 于96 孔酶标板中，再加入ABTS＋·工作液200 μL，暗反应6 min，于酶标仪734 nm 处测定吸光值。配制浓度为0.003、0.006、0.009、0.012、0.015、0.018 mg/mL 的VC 溶液作为对照。根据公式(3)计算清除率。

式中:A3为ABTS 自由基和蒸馏水的吸光值；A4为紫萁黄酮提取液和ABTS 自由基的吸光值；A5为紫萁黄酮提取液和蒸馏水的吸光值。

1.4 数据处理

所有试验均重复3 次，采用软件Design－Expert 12、Origin 2018、SPSS 26 对数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声时间对紫萁黄酮得率的影响 由图1可知，紫萁黄酮得率随超声时间的延长呈先增后减的趋势，20 min 时得率最高，为3.113%；继续延长超声时间，得率显著减少，可能是超声产生的空化效应、搅拌作用破坏了黄酮的结构[27]，影响紫萁黄酮得率。因此超声时间选择20 min 为宜。

图1 超声时间对紫萁黄酮得率的影响

2.1.2 纤维素酶添加量对紫箕黄酮得率的影响

由图2 可知，随着纤维素酶添加量的增加，紫萁黄酮的得率先增加后减少，添加量为1.0%时得率最高，为3.468%；之后，紫萁黄酮得率随着酶添加量的增加反而显著性降低，可能是随着纤维素酶添加量的增加，酶和分解后的纤维素会阻止黄酮类化合物与提取溶剂的接触，导致紫萁黄酮得率降低[21]。因此选择0.6%、1.0%、1.4%的纤维素酶添加量进行响应面试验。

图2 纤维素酶添加量对紫萁黄酮得率的影响

2.1.3 液料比对紫箕黄酮得率的影响 由图3可知，在液料比10～40 mL/g 范围内，随着液料比的增加，紫萁黄酮得率呈显著上升趋势，液料比为40 mL/g 时得率最高(3.624%)；继续增加液料比，紫萁黄酮得率显著下降。原因可能是随着液料比增大，液体体积增加，体系黏度降低，传质过程加快，紫萁黄酮得率相应得到提高；当液料比增加到一定程度，体系中可能会有一些可溶性物质随溶剂溶出，导致体系黏度上升，扩散系数随之降低，从而导致紫萁黄酮得率下降[28]。综上，选择30、40、50 mL/g 的液料比进行响应面试验。

图3 液料比对紫萁黄酮得率的影响

2.1.4 乙醇浓度对紫箕黄酮得率的影响 由图4可知，乙醇浓度为40%时，紫萁黄酮得率达到最高峰3.513%；再继续升高乙醇浓度，紫萁黄酮得率呈显著下降趋势。乙醇对细胞穿透能力强，溶解性好，用不同浓度的乙醇处理紫萁粉时，会使细胞内外形成浓度差，有利于细胞内部紫萁黄酮的溶出；当乙醇浓度达到40%时，可能紫萁黄酮的溶出已经趋于饱和，而随着乙醇浓度的持续增加，一些能够溶解于乙醇的杂质、色素等溶出，导致紫萁黄酮得率出现下降趋势；同时较高浓度的乙醇可能也会抑制纤维素酶活性，导致黄酮溶出变少[29]。综上，选择30%、40%、50%的乙醇浓度进行响应面试验。

图4 乙醇浓度对紫萁黄酮得率的影响

2.1.5 酶解时间对紫箕黄酮得率的影响 由图5可知，随着酶解时间的延长，紫萁黄酮得率呈先升后降趋势，40 min 时得率达到最高，为3.801%，之后得率显著下降。原因可能是随着酶解时间的延长，纤维素酶与底物的作用越充分，细胞壁被完全破坏，紫萁细胞内部黄酮充分溶出；但当继续延长酶解时间，底物浓度降低或者产物积累会对酶的活性有抑制作用[30]。故酶解时间选择40 min 为宜。

图5 酶解时间对紫萁黄酮得率的影响

2.1.6 超声功率对紫箕黄酮得率的影响 由图6可知，随着超声功率的增大，紫萁黄酮得率呈先升后减趋势，超声功率为300 W 时得率达到最大值，为4.156%，之后得率显著下降。原因是随着超声功率的增大，所产生的空化效应及振荡作用相应增强，对细胞壁的破坏程度也增强，有利于细胞内黄酮的溶出，紫萁黄酮得率升高；然而超声功率过大可能会引起黄酮内部结构破坏，导致黄酮损失，因此紫萁黄酮得率降低[31]。综上，选择200、300、400 W 的超声功率进行响应面试验。

图6 超声功率对紫萁黄酮得率的影响

2.2 紫萁黄酮提取响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验结果及回归模型方差分析由表2 所示，通过回归分析得到二次多项回归方程为:Y＝4.310－0.003A＋0.200B＋0.100C＋0.007D－0.018AB＋0. 025AC ＋0. 0170AD － 0. 055BC －0.012BD＋0.035CD－0.081A2－0.240B2－0.440C2－0.230D2。

表2 响应面试验设计及结果

由表3 可知，模型P<0.0001，表示该回归模型差异极显著；失拟项的P>0.05，表明模型与试验因素拟合较好；模型的决定系数R2＝0.9899，调整系数R2Adj＝0.9798，进一步表明此模型精确度高，试验设计较可靠，可用此模型对紫萁黄酮提取工艺进行分析和理论预测。

从表3 可看出，一次项B、C，二次项A2、B2、C2、D2对紫萁黄酮得率的影响达到差异高度显著水平(P<0.01)，交互项BC 对紫萁黄酮得率的影响达到差异显著水平(P<0.05)，这说明各因素综合交互影响紫萁黄酮得率。4 个因素对紫萁黄酮得率影响的顺序为:液料比(B)>乙醇浓度(C)>超声功率(D)>纤维素酶添加量(A)。

表3 响应面试验二次模型方差分析

2.2.2 响应面各因素交互作用分析 响应面图曲面坡度越陡、等高线越密集，表示响应面值受该因素影响就越大。从图7 可看出，乙醇浓度与液料比交互作用的响应面图最陡峭，等高线较密集，说明该交互作用对紫萁黄酮提取率的影响最显著，而其余交互项显著性相对较差。

图7 两两因素交互作用对黄酮得率影响的响应面和等高线图

2.2.3 验证试验 通过回归模型预测，得到最佳提取工艺条件为:超声时间20 min、纤维素酶添加量0.98%、液料比44 mL/g、乙醇浓度40%、酶解时间40 min、超声功率300 W，得率4.357%。结合实际情况，将预测最佳工艺条件优化为:纤维素酶添加量0.98%、液料比44 mL/g、乙醇浓度40%、超声功率300 W。同时进行3 次平行试验验证，实际得率为(4.371±0.020)%，与模型预测值相差较小，证实了该模型的可靠性和有效性，具有一定实用价值。

2.3 紫萁黄酮抗氧化活性结果

2.3.1 DPPH 自由基清除能力 由图8 可知，紫萁黄酮对DPPH 自由基的清除率随着质量浓度的增加而逐渐增强，当质量浓度为0.6 mg/mL 时，清除率达到93.23%，表明其具有一定的量效关系。通过计算，紫萁黄酮与VC 对DPPH 自由基清除率的IC50值分别为0.169 、0.015 mg/mL。

图8 紫萁黄酮与VC 对DPPH 自由基的清除率

2.3.2 ABTS 自由基清除能力 由图9 可知，随着紫萁黄酮质量浓度的增大，其对ABTS 自由基的清除率不断升高，当质量浓度为0.24 mg/mL时，清除率为85.72%，表明其具有一定的量效关系。通过计算，紫萁黄酮与VC 对ABTS 自由基清除率的IC50值分别为0.101、0.008 mg/mL。

图9 紫萁黄酮VC 对ABTS 自由基的清除率

3 结论

本试验采用超声波酶法辅助提取紫萁黄酮，考察了6 个因素对紫萁黄酮得率的影响，并通过响应面法优化提取工艺，得到最佳提取工艺条件为:超声时间20 min、纤维素酶添加量0.98%、液料比44 mL/g、乙醇浓度40%、纤维素酶解时间40 min、超声功率300 W，得率可达4.371%。这为袁亮等[32]采用80%乙醇提取陕南紫萁黄酮得率的2.8 倍，田国政等[15]采用60%乙醇提取湖北紫萁黄酮得率的3.4 倍，可见超声波酶法能够较好地对紫萁中的黄酮类物质进行提取。抗氧化活性研究发现紫萁黄酮清除DPPH、ABTS 自由基的IC50值分别为0.169、0.101 mg/mL，其清除率是随紫萁黄酮质量浓度的升高而加强，具有一定的量效关系。该研究结果可为紫萁资源的进一步开发利用提供理论依据。