牛病毒性腹泻病毒片段可溶表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

张宇名，李树凡，陈志远，迟丽丽，刘健，于泽海，张玫瑜，康京丽，徐守振

(1. 青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109；2. 中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266032)

目前现有的BVDV 诊断方法，如病毒分离、病毒中和、免疫琼扩、免疫组化及核酸检测等，或因通量低、工作量大，或因要求专业人员或相关精密仪器等原因，无法适应牧场高通量牛群筛选等工作，导致不能在牧场普及推广。酶联免疫吸附试验(ELISA)有着通量高、操作简单快捷、灵敏性及特异性好等优点，被广泛应用于牧场检测和筛查BVDV。Erns(E0 或gP48)蛋白是BVDV 编码蛋白中保守性较高的蛋白，存在中和表位，能刺激机体产生中和抗体[5]。Erns蛋白为组成BVDV 的囊膜糖蛋白之一，含有8 个可糖基化位点，可与细胞表面黏多糖特异性结合[6]。对Erns蛋白氨基酸序列的分析得知，Erns蛋白中含有一段保守性较高的结构区域[7]，Erns蛋白在诊断抗原领域具有重要意义。Deng 等[8]在2015年对我国BVDV 流行亚型的调查结果显示，BVDV－1m 为我国主要流行亚型。本研究对BVDV－1m 亚型标准株Erns蛋白进行分析及优势表位预测，利用大肠杆菌原核表达重组Erns截短蛋白，建立基于此蛋白的BVDV 抗体间接ELISA 检测方法，以期为山东地区BVDV防控净化及BVDV 临床检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 样品与载体

试验所用待检血清收集自山东地区规模化奶牛场，BVDV 抗体阴阳性牛血清均使用美国IDEXX 公司BVDV 抗体ELISA 检测试剂盒(Ab99－44000)确认。牛传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)抗体阳性牛血清、牛副结核(Map)抗体阳性牛血清、牛支原体(MB)抗体阳性牛血清均由本实验室保存。pCold TF 载体购自北京华越洋生物科技有限公司。

1.2 主要试剂

PEG 8000 及脱脂乳粉购自Sangon Biotech 公司；His－Tagged Protein Purification Kit(Soluble Protein)购自北京康为世纪生物科技有限公司；马血清购自biosharp 公司；酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、兔抗牛HRP 标记抗体、TMB 单组份显色液购自Solarbio 公司。

1.3 Erns蛋白抗原表位分析与截短片段选取

根据GenBank 中收录的山东地区BVDV－1m亚型标准株SD－15(登录号:KR866116.1)获取Erns蛋白全长序列，并送至深圳华大基因股份有限公司进行质粒合成。使用DNAstar 软件及IEDB库对选取的Erns蛋白全长氨基酸序列进行分析，预测其抗原表位分布情况，并使用德泰在线抗原决定簇预测工具采用Kolaskar－Tongaonkar、Parker、Chou－Fasman、Karplus－Schulz、Emini 五种预测算法加以验证，以选取抗原表位密集且亲水性较好的Erns蛋白截短片段作为目的序列用于后续试验。

1.4 重组载体构建及鉴定

根据选取的Erns片段序列使用Oligo 7 软件进行引物设计，并分别在上下游引物插入EcoRⅠ、XbaⅠ酶切位点(小写字母处)。上游引物:5′－ccggaattcATGGATGCAAGTGAGAAGAC－ 3′，下游引物:5′－gctctagaATTCTTCCCCTTCTTACAGC－3′，送至Sangon Biotech 公司合成。以SD－15 Erns全长序列为模板，扩增Erns蛋白截短片段。扩增体系:上下游引物各1 μL，模板2 μL，2 ×TransTaqHiFi PCR SuperMixⅠ(－dye)12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增程序:94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共35 个循环；72℃10 min。片段与pCold TF 载体双酶切后通过T4 DNA 连接酶进行连接。连接体系:pCold TF 纯化片段2 μL，目的基因纯化片段6 μL，T4 DNA 连接酶1 μL，10×T4 Buffer 1 μL。连接完成后转化DH5α 感受态细胞，转化条件:冰浴解冻DH5α 感受态细胞后移入10 μL 重组质粒，冰浴30 min；42℃热激转化90 s，冰浴2 min；加入无抗性LB 液体培养基37℃慢速摇菌1 h 复苏；3 000 r/min 低速离心6 min，重悬菌体涂布于Amp＋固体LB 培养基，置于37℃恒温箱培养12～16 h，进行双酶切及测序鉴定。

1.5 重组蛋白表达及纯化

章学诚，字实斋，号少岩。浙江会稽(今绍兴)人，生于清乾隆三年(1738)，卒于嘉庆六年(1801)，终年64岁。其生活的时代，正是历史上所谓的“乾嘉时代”。

1.6 表达产物Western blot 及LC－MS/MS 鉴定

采用湿转法进行Western blot 鉴定。100 V恒压转膜100 min；5% BSA 封闭液室温封闭1 h；1∶2000 稀释鼠源抗His 标签一抗，4℃孵育过夜；1∶2000稀释兔抗鼠HRP 标记抗体，室温孵育1 h；按照上海碧云天生物技术有限公司BeyoECL Plus试剂盒说明进行显色。为进一步鉴定目的蛋白的表达情况，取超声破碎后菌体上清送至上海拜谱生物科技有限公司进行液相色谱串联质谱LCMS/MS(1 h)鉴定。

1.7 间接ELISA 方法的优化

对纯化后的Erns截短蛋白以常规间接ELISA方法作为基础，采用单因素变量试验，分别对影响间接ELISA 反应的各因素进行方阵优化:抗原包被浓度(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/mL)；最佳封闭液(1% BSA、5% 脱脂乳粉、5%PEG 8000、1%酪蛋白、5%马血清、10%马血清)；一抗稀释度(1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1 ∶640)；二抗稀释度(1 ∶5000、1 ∶8000、1∶12000)；抗原包被时间(4℃过夜，37℃1 h 后4℃过夜，37℃2 h 后4℃过夜)；封闭时间(1.5、2.0、2.5、3.0 h)；一抗孵育时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)；二抗孵育时间(20、40、60、80、100、120 min)；显色时间(10、15、20、25、30 min)。试验均做3 次平行重复，并计算变异系数，以评估试验可重复性。

1.8 间接ELISA 方法的阴阳性临界值确定

取45 份经商品化ELISA 试剂盒检测为BVDV 抗体阴性的牛血清，根据所测得OD450值结果计算临界平均值及标准偏差S，根据阴阳性临界判定规则(＋3S)确定间接ELISA方法的阴阳性临界值。

1.9 间接ELISA 方法的特异性试验

将优化后的ELISA 方法对BVDV 抗体阳性牛血清、IBRV 抗体阳性牛血清、Map 抗体阳性牛血清、MB 抗体阳性牛血清以及BVDV 抗体阴性牛血清进行同步检测，以评估本ELISA 方法的特异性。试验均做3 次平行重复，并计算变异系数。

1.10 间接ELISA 方法的敏感性试验

将BVDV 抗体阳性牛血清按二倍比稀释至1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560 倍，使用优化后的ELISA 方法进行检测，以评估本ELISA 方法的敏感性。试验均做3 次平行重复，并计算变异系数。

1.11 间接ELISA 方法临床样品试验

应用本ELISA 方法与IDEXX 公司BVDV 抗体ELISA 检测试剂盒同时检测92 份临床牛血清样品，比较检测结果，计算阴阳性符合率。

2 结果与分析

2.1 Erns蛋白抗原表位预测与截短片段的选取

使用DNAstar 软件对BVDV Erns蛋白全长氨基酸序列的正电荷分布、无规卷曲、亲水区、表面可及性及抗原表位区域进行预测，结果见图1A；IEDB 在线数据库预测抗原表位结果见图1B；德泰在线抗原决定簇预测结果见图1C。综合多种预测结果，本研究选取Erns蛋白中亲水性较强、抗原指数高、表面可及性较好的60 ～ 145 aa 区域()作为后续间接ELISA 方法的包被抗原。

2.2 重组载体构建与鉴定结果

图2 片段PCR 扩增结果

图3 pCold TF－双酶切结果

2.3 重组蛋白表达及纯化结果

SDS－PAGE 结果显示，超声后菌体上清成功可溶表达出片段，大小为73.86 kDa，与预期大小相符(图4)。纯化后结果显示，非目的蛋白数量明显减少，在300 mmol/L 咪唑浓度时收集到最大洗脱峰(图5)。

图4 蛋白表达结果

图5 蛋白纯化结果

2.4 表达产物Western blot 及LC－MS/MS 鉴定结果

图6 蛋白Western blot 结果

图7 蛋白LC－MS/MS 鉴定结果

2.5 间接ELISA 方法的方阵优化结果

2.5.1 抗原包被浓度优化 结果显示，抗原包被浓度为0.25 μg/mL 时，阴阳性P/N 值最大，变异系数低于15%，重复性良好(表1)。

表1 抗原包被浓度优化

2.5.2 最佳封闭液选择 结果显示，封闭液为10%马血清时，阴阳性P/N 值最大，变异系数低于15%，重复性良好(表2)。

表2 最佳封闭液选择

2.5.3 一抗稀释度优化 结果显示，一抗稀释度为1 ∶5 时，阴阳性P/N 值最大，变异系数低于15%，重复性良好(表3)。

表3 一抗稀释度优化

2.5.4 二抗稀释度优化 结果显示，二抗稀释度为1∶8000 倍时，阴阳性P/N 值最大，变异系数低于15%，重复性良好(表4)。

表4 二抗稀释度优化

2.5.5 抗原包被时间优化 结果显示，包被时间为37℃2 h 后4℃过夜时，阴阳性P/N 值最大，变异系数低于15%，重复性良好(表5)。

表5 抗原包被时间优化

2.5.6 封闭时间优化 结果显示，封闭时间为1.5 h时，阴阳性P/N 值最大，变异系数低于15%，重复性良好(表6)。

表6 封闭时间优化

2.5.7 一抗孵育时间优化 结果显示，一抗孵育时间为2.5 h 时，阴阳性P/N 值最大，为5.169，但孵育时间为1.5 h 时，P/N 值为5.013，二者相差不大，不存在显著性差异(P＝0.400)。本着节省时间原则，选用孵育1.5 h，其变异系数低于15%，重复性良好(表7)。

表7 一抗孵育时间优化

2.5.8 二抗孵育时间优化 结果显示，二抗孵育时间为60 min 时，阴阳性P/N 值最大，变异系数低于15%，重复性良好(表8)。

表8 二抗孵育时间优化

2.5.9 显色时间优化 结果显示，显色时间为25 min 时，阴阳性P/N 值最大，变异系数低于15%，重复性良好(表9)。

表9 显色时间优化

经过方阵优化后最终条件为:0.25 μg/mL 抗原包被37℃2 h 后4℃过夜，10%马血清封闭时间1.5 h，1∶5 稀释一抗孵育1.5 h，1∶8000 稀释二抗孵育60 min，显色25 min。

2.6 间接ELISA 方法阴阳性临界值确定结果

使用优化后的条件，对45 份BVDV 抗体阴性牛血清OD450值进行检测(表10)，测得OD450平均值为0.301，标准偏差S 为0.049。根据阴阳性临界判定规则确定本ELISA 方法的阴阳性临界值为0.448，即样品OD450值≥0.448 时判定为阳性，样品OD450值<0.448 时判定为阴性。

表10 45 份BVDV 抗体阴性牛血清OD450值

2.7 间接ELISA 方法特异性试验结果

特异性试验结果(表11)显示，仅BVDV 抗体阳性牛血清OD450值大于0.448，其他均为阴性，表明本间接ELISA 方法具有良好的特异性，且变异系数低于15%，重复性良好。

表11 间接ELISA 特异性试验结果

2.8 间接ELISA 方法敏感性试验结果

敏感性试验结果显示，当阳性血清稀释1 280 倍时，OD450值仍大于0.448，表明本方法具有良好的敏感性，且变异系数低于15%，重复性良好(表12)。

表12 间接ELISA 敏感性试验结果

2.9 间接ELISA 方法临床样品试验结果

使用间接ELISA 方法与IDEXX 公司BVDV抗体ELISA 检测试剂盒同时检测92 份临床牛血清样品，并对检测结果进行统计学分析，结果(表13)显示，两者阳性符合率为86.15%，阴性符合率为92.59%，总体符合率为88.04%。

表13 临床样品试验结果

3 讨论与结论

BVDV 临床发病率高、症状复杂、可跨物种传播，给整个畜牧行业带来严重安全隐患[9]。怀孕早期的母牛一旦感染，常通过胎盘使胎儿产生免疫抑制[10]，如果小牛正常产出，一出生便为持续感染(persistent infection，PI)牛。PI 牛体内始终带毒且持续排毒、无临床症状、血清中又无保护性抗体，是牛群中决定性传染源，由此造成的经济损失巨大。欧洲、澳大利亚、新西兰等国家均通过淘汰牛群中的PI 牛和全群免疫，有效地控制了BVD－MD[11.12]。BVD－MD 的筛选与净化对养牛业健康发展影响重大，对牛群进行BVDV 抗体筛查不仅可以追踪牛群近期感染BVDV 的情况，判定牛只感染状态，也能作为筛选和净化PI 牛的辅助手段[13－15]。因为PI 牛不能产生中和抗体，因此进行牛群BVDV 抗体筛选，可以缩小PI 牛筛查范围，提高效率。对于BVDV 抗体筛查，当前常用的方式包括中和试验及间接ELISA 试验，相较于中和试验，间接ELISA 方法更方便快捷、适用于大规模检测，故临床中多采用间接ELISA 方法。BVDV 国际标准ELISA 检测试剂盒长期由国外公司垄断、价格昂贵、获取困难，因此国产试剂盒研制与应用刻不容缓。

BVDV－1m 为近年来我国主要流行亚型[8]，且前期研究针对2019—2021年山东地区规模化奶牛场BVDV 亚型遗传进化分析的结果亦显示BVDV－1m 为近年来山东地区规模化奶牛场优势流行亚型，故本ELISA 方法选用山东地区BVDV－1m 亚型标准株作为包被抗原序列来源。BVDV在我国存在众多流行亚型，单独选择某种BVDV亚型蛋白进行表达难免有失偏颇，为兼顾其他BVDV 亚型存在及流行的客观现状，本研究选取BVDV 多聚蛋白中在各亚型间保守性较好的Erns蛋白作为ELISA 方法的包被抗原。通过原核表达BVDV Erns蛋白全长，表达产物多以包涵体形式存在[16－18]。本试验前期尝试过直接使用BVDV Erns蛋白全长进行原核表达，表达产物存在于包涵体中，与上述结果相符。之前研究通过使用盐酸胍变性复性法尝试进行包涵体处理，通过先将包涵体蛋白变性溶解在变性缓冲液中，再缓慢滴加至复性缓冲液中进行复性，最终通过透析手段去除相关试剂残留，得到的复性BVDV Erns蛋白浓度低(0.386 mg/mL)，蛋白损失极大，使用该蛋白作为包被抗原进行间接ELISA 方法预试验，结果显示阴阳性差值过小，复性率很低。因此本研究对BVDV Erns蛋白进行亲水性预测和抗原表位分析，选定作为间接ELISA 方法的包被抗原，表达量高于Erns蛋白全长，且为可溶性表达，在试验中表现良好；通过Western blot 及LC－MS/MS 鉴定显示，所选蛋白表达正确，具有良好的抗原性，故最终选定蛋白作为间接ELISA方法的包被抗原。本方法包被蛋白浓度仅需0.25 μg/mL 便可进行，用量少，成本低；选用10%马血清作为封闭液，相比固态封闭液(需称量、溶解)配置更为方便、准确；酶标二抗稀释度为1∶8000，成本可控；抗原包被后，隔天检测用时可控制在6 h 之内；能够正确区分牛群常见病原IBRV、Map、MB，特异性良好；可以检测到最低稀释至1 280倍的BVDV 抗体阳性牛血清，灵敏性良好；在整个ELISA 方阵优化及后续特异性、敏感性试验中持续进行重复性试验，变异系数一直控制在15%以内，重复性良好；与IDEXX 公司BVDV 抗体检测试剂盒平行检测试验中，两者阳性符合率为86.15%，阴性符合率为92.59%，总体符合率为88.04%，符合率良好。ELISA 方法建立过程中，考虑到若不使用相关蛋白保护成分而直接包被蛋白后保存进行定期批间重复试验会导致蛋白降解，影响阴阳性临界值的标定和结果读取，故本方法未设置批间重复试验，只进行批内重复试验，以保证结果读取的准确性。如后续有对保存时间的需求，应进一步对相关蛋白保护剂进行研究。本方法尝试使用10%无菌甘油作为蛋白冻存保护剂，效果良好，能够保护蛋白在反复冻融过程过度降解，也可采用蛋白分装保存的方式避免反复冻融。

进行牛群BVDV 净化及筛选淘汰PI 牛，利于降低牛群BVDV 整体发病率，也利于保护奶牛养殖业健康有序发展。山东地区作为我国东部地区重要的奶牛规模化养殖省份，近年来BVDV 流行情况较为严重，建立一种适应于当前山东地区乃至全国规模化奶牛场BVDV 优势流行亚型的检测方法作为技术储备，具有较强的现实意义。