转基因玉米MON87419实时荧光定量PCR检测方法的建立

李凌燕，陈红，马玥，张旭冬，陈子言，王颢潜，张秀杰，梁晋刚

(1. 农业农村部科技发展中心，北京 100176；2. 北京农业职业学院，北京 102442)

近年来，转基因作物的种植和商业化在全球范围内迅速发展。国际农业生物技术应用服务组织(ISAAAA)统计结果表明，截至2018年全球已经有70 多个国家种植进口转基因作物，转基因作物种植面积已经达到1.9 亿hm2[1]。随着转基因作物的大范围推广，转基因产品标识制度已经成为全球转基因监管的重要手段。我国颁布«农业转基因生物标识管理办法»对我国转基因作物进行管控[2]以保护消费者的知情权，而建立可靠的定量检测方法是保障转基因生物标识制度顺利实施的必然技术要求。

实时荧光定量PCR 技术是利用PCR 扩增过程中荧光信号的积累，实现对PCR 反应进程的实时监测，最后通过建立双标准曲线以达到对DNA 定量分析的目的，具有高灵敏性、可检测单个细胞基因、高特异性和准确性、操作简单快捷和安全无污染等优点。目前大多数转基因作物品系如转基因玉米[3]、水稻[4]、棉花[5]等已经建立PCR 定量检测系统。

转基因玉米MON87419 是由孟山都远东有限公司开发的转基因耐除草剂玉米，其中插入耐除草剂基因(dom、pat)，表现出对麦草畏和草铵膦良好的抗性。目前国内外还没有对该转基因作物的定量检测方法， 因此建立转基因玉米MON87419 的定量检测方法对其有效监管和转基因的检测评价是十分必要的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品 转基因玉米MON87419 及其受体玉米种子均为2019年由孟山都远东有限公司提供。

其他转基因玉米混样、转基因大豆混样、转基因水稻混样、转基因油菜混样、转基因棉花混样和非转基因大豆、玉米、棉花等样品均由本实验室保存。各种混样的制备方法:多种转化体按1%质量百分比混合而成，不足部分用相应的非转基因作物补齐(表1)。

表1 转基因作物混合样品

1.1.2 主要试剂 植物基因组DNA 提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；TaqManTMGene Expression Master Mix、DL1000 DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器设备 台式冷冻离心机(Eppendorf)；Q5000 超微量紫外分光光度计(Quawell)；CFX 96荧光定量PCR 扩增仪(Bio－Rad，美国)。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA 提取 将转基因耐除草剂玉米MON87419 及其受体种子育苗。按照植物基因组DNA 提取试剂盒操作说明书提取玉米植株基因组DNA，其余转基因混样和非转基因样品分别提取DNA，分光光度计测定浓度，用1×TE 缓冲液稀释至50 ng/μL 用于后续试验。

1.2.2 引物设计与筛选 利用探针设计软件Beacon Designer 8 在序列两端设计荧光探针和引物，并进行引物/探针正交组合，按照农业部2259 号公告－4－2015 标准规定的PCR 扩增产物大小为80～200 bp 的要求选出引物/探针组合[6]。

以1.2.1 提取的转基因玉米MON87419 基因组DNA 为初始浓度，配制10%的DNA 作为模板，采用通用实时荧光定量PCR 反应体系和反应程序[7]，根据结果选择扩增信号最强和Ct 值最小的引物/探针组合作为定量检测方法的候选引物。

1.2.3 反应体系优化 以1.2.1 提取的转基因玉米MON87419 基因组DNA 为初始浓度，配制10%的DNA 作为模板，探针浓度分别设置为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L，引物浓度为探针浓度的2倍，进行实时荧光定量PCR 扩增，根据Ct 值筛选最优组合。

1.2.4 特异性检测 以1.2.1 提取的转基因玉米MON87419 基因组DNA 为初始浓度，配制1%DNA 作为阳性对照，受体玉米DNA 为阴性对照，采用其他转基因作物混样和非转基因作物DNA进行特异性检测。

1.2.5 双标准曲线的建立 以1.2.1 提取的转基因玉米MON87419 基因组DNA 为初始浓度，稀释成5 个不同含量的标准样品(表2)，以优化后的反应体系及反应程序进行实时荧光PCR 反应，每个PCR 反应设置3 个平行。根据PCR 反应的Ct值和初始模板拷贝数的对数分别绘制MON87419和玉米内标准基因zSSIIb的标准曲线。

表2 耐除草剂玉米MON87419 转化体检测体系中的DNA 含量及拷贝数

1.2.6 正确度及精密度检测 以1.2.1 提取的转基因玉米MON87419 基因组DNA 为初始浓度，配制5%、1%和0.1%的DNA 样品，以1.2.3 优化后的反应体系及反应程序进行实时荧光PCR 反应。每个反应3 个平行，共进行3 次重复试验，按照以下公式计算转基因含量:MON87419 转基因含量(%) ＝MON87419 拷贝数/zSSIIb拷贝数×100。计算多次测试的偏差(Bias)和相对标准偏差(RSD)。

1.2.7 定量限(LOQ)测定 目标浓度参考欧盟阈值0.9%，本方法将目标浓度设定为1%。根据农业部2259 号公告－5－2015 标准[8]规定转基因检测方法确定定量限不高于0.1%。

采用18 份转基因玉米MON87419 含量为0.1%(PCR 反应体系中加入100 ng 模板)的DNA样品进行定量测试。

1.3 数据处理与统计分析

采用SPSS 18.0 统计软件计算平均值、变异率(CV)、标准差(SD)、相对标准偏差(RSD)及偏差(Bias)。

2 结果与分析

2.1 引物、探针设计与筛选

鉴于5′端GC 含量较低，仅在3′端设计出合适的引物与探针(表3)。

表3 耐除草剂玉米MON87419 转化体实时荧光PCR 检测候选引物和探针

将引物与探针正交组合12 对，连同孟山都提供的引物/探针(3′－13)共13 对(表4)，按照扩增信号最强和Ct 值最小的原则进行筛选。结果(图1)表明，试验设计的12 对引物/探针组合均获得特异性扩增，其中3′－3、3′－6、3′－9 和3′－12 扩增Ct 值最小，扩增效果最好。按照探针设计原则，3′－9 和3′－12探针位置更接近上游，选择3′－9 和3′－12 与孟山都提供的3′－13 进行下一步验证。如图2 所示，3′－13扩增曲线Ct 值更小，显著优于其余引物/探针组合，故选用3′－13 作为候选引物/探针组合进行后续试验，并命名为MON87419－QF/QR/QP。

表4 耐除草剂玉米MON87419 转化体实时荧光PCR 检测引物/探针组合

图1 耐除草剂玉米MON87419 转化体实时荧光PCR 引物探针的初步筛选

图2 耐除草剂玉米MON87419 转化体引物探针组合3′－9、3′－12 与3′－13 比较

2.2 反应体系优化

如图3 所示，随探针浓度的增加荧光扩增曲线上升幅度增加，Ct 值略有减少，当探针浓度为0.4 μmol/L 时，随着浓度的增加Ct 值基本不变。综合考虑扩增效率和体系配置的适用性等因素确定检测引物浓度为0.8 μmol/L，探针浓度为0.4 μmol/L。

图3 耐除草剂玉米MON87419 转化体实时荧光PCR 引物探针反应浓度优化

2.3 特异性检测

如图4 所示，仅在耐除草剂转基因玉米MON87419 中获得扩增曲线，而在其他转基因作物混样和非转基因作物中均未获得扩增曲线，表明本方法筛选的引物/探针具有很好的特异性。

图4 耐除草剂玉米MON87419 转化体实时荧光PCR检测方法特异性测试

2.4 标准曲线的建立

根据标准DNA 溶液PCR 反应的Ct 值及初始模板拷贝数的对数分别绘制MON87419 和zSSIIb的标准曲线(图5)。结果表明，3 次平行试验中MON87419 和zSSIIb检测体系的Ct 值和模板拷贝数间均有良好的线性关系。

图5 耐除草剂玉米MON87419 转化体和玉米内标准基因zSSIIb 的标准曲线

2.5 正确度及精密度检测

3 次重复测试结果显示3 个浓度测试的偏差(Bias)、标准偏差(SD)和相对标准偏差(RSD)≤25%(表5)。说明MON87419 检测方法的正确度与精密度均符合农业部2259 号公告－5－2015 的要求，具有较好的重复性。

表5 耐除草剂玉米MON87419 转化体检测方法的正确度和精密度测试

2.6 定量限(LOQ)的确定

如表6 所示，18 份转基因玉米MON87419 含量为0.1%的DNA 样品偏差和相对标准偏差均≤25%，由此确定本研究的定量限为0.1%。

表6 耐除草剂玉米MO87419 转化体实时荧光PCR 方法定量限测试结果

3 讨论与结论

伴随着转基因标识制度的实施和国家对转基因作物安全监管力度的加强，转基因作物的定量检测已成为产业发展的必然要求。我国多侧重于定性检测转基因作物方法的研究，如转基因大豆MON87701、DP356043、CV－127 等定性检测方法的建立，温洪涛[9]、武文艳[10]等利用实时荧光定量技术分别建立了耐除草剂玉米G1105E－823C、抗虫玉米2A－5 的定性检测方法，Yang 等[11]以质粒为标准品建立了MON863、Bt11 等多个转基因玉米定量检测方法。但目前只有转基因耐除草剂大豆GTS 40－3－2 和抗虫水稻TT51－1 国家标准的定量检测方法[12，13]， 未见转基因玉米MON87419 定量检测方法的相关研究。本研究以转基因玉米MON87419 的DNA 为模板，定量准确性更高，应用范围更广。

目前国际认可的转基因定量成分分析方法主要是实时荧光定量PCR 以及数字PCR。数字PCR 无需借助标准曲线即可实现绝对定量样品的目的，国内外研究者[14－16]利用数字PCR 的方法研制出多个玉米转化体的定量检测方法，但数字PCR 作为一种新兴技术，成本高，设备普及率较低，尚未建立相关的检测标准。实时荧光PCR技术具有特异高效、稳定便捷等优点，现已广泛用于转化体的定量检测[17－19]，但是需要依赖建立标准曲线进行样品的绝对定量。随着检测技术的发展，建议逐步建立数字PCR 检测的相关标准，实际检测中可根据样品情况灵活结合运用实时荧光PCR 与数字PCR，使新技术更好地服务于社会大众。

本研究建立的实时荧光定量PCR 方法能够准确定量模板DNA 的含量，具有良好的特异性、准确性和重复性。其定量限为0.1%，能够满足该转化体的检测需要，可为耐除草剂转基因玉米MON87419 的定量检测和有效监管提供新的技术手段和有力支撑。