环境微生物数据库的建立及在溯源分析中的应用*

赵丽元，丁红雨，高洪霞，张敬武，张兴哲

（辽宁省大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁 大连 116021）

在无菌药品的生产中，环境监控是评估生产环境微生物污染情况的重要手段，我国《药品生产质量管理规范》（GMP）［1］及美国GMP［2］中均有明确要求。环境监控数据中的微生物数据，不仅要关注数量，更应关注其种类和特点，即对环境监控过程中发现的污染菌进行鉴定，并根据情况选择性保存，定期对相应数据和信息进行汇总和分析，这一措施称为环境菌数据库建设［2-3］。建设环境菌数据库，有助于建立和健全企业微生物监控方法，完善企业微生物风险评估和质量保证体系，增强微生物污染的溯源分析能力，从源头上避免微生物污染，保证药品质量［4-9］。本研究中通过收集、鉴定一家无菌药品生产企业环境菌，建立了覆盖药品生产全过程的企业生产环境微生物数据库，形成环境微生物分布图，通过分布图全面客观地掌握生产环境。此外，利用数据库为企业成功进行了一次无菌污染事件溯源分析，供更多企业的溯源分析时借鉴。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、培养基和试剂、引物

仪器：AC2 - 4S1 型生物安全柜（新加坡Esco 公司）；VITEK 2 COMPACT型全自动微生物药敏与分析系统，VITEK®MS型MODI-TOF质谱仪，均购于法国梅里埃公司；BAXQ7型全自动病原微生物快速检测系统，全自动微生物基因指纹鉴定系统均购于杜邦公司；DYCP-31CN 型琼脂糖凝胶电泳仪及成像系统（美国Bio-Rad公司）；BD240型生化培养箱（德国Binder公司）。

培养基和试剂：胰酪大豆胨琼脂培养基，沙氏葡萄糖琼脂培养基，均购于北京陆桥有限公司；裂解液，聚合酶链式反应（PCR）酶Premix Taq，均购于宝生物工程（大连）有限公司。

引物：细菌用16srRNA 通用扩增引物27F 和1492R，霉菌用引物ITS1 和 ITS4，酵母菌用引物 D1 和D2 进行测序，均购于生工生物工程（上海）股份有限公司。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers

1.2 方法

环境微生物监控：与企业共同制订环境监控方案，监测项目包括原辅料、包装材料、环境监测、人员、制药用水、表面消毒、除菌过滤膜、质量控制实验室8 个方面，基本覆盖了生产和检验的全过程，历时10 个月，监测频率以生产情况和已往的风险评估数据为准。

微生物鉴定：将收集到的微生物分离培养、纯化后进行鉴定，同时用20%甘油保存菌种，作为环境微生物菌种实物库。鉴定以分子水平鉴定为主，如有疑问可以生化鉴定为补充。1）菌体裂解。取1 接种环或枪头尖接种入50 μL 裂解液中，80 ℃裂解15 min（真菌需裂解45 min），离心（转速为3 000 r/min）2 min，取上清液，作为 PCR 模板。2）PCR 反应体系（50 μL）。模板 3 μL；Premix Taq 25 μL；上游引物 1 μL；下游引物1 μL；双蒸水（ddH2O）20 μL。3）PCR 条件。94 ℃预变性 10 min，94 ℃变性1 min；55 ℃退火1 min（真菌58 ℃退火1 min）；72 ℃延伸1 min，40 个循环；72 ℃再循环5 min。4）测序。PCR 产物由生工生物工程（上海）股份有限公司以对应引物为测序引物进行一代测序。

测序结果分析：将测序结果拼接核对后，利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库进行Blast 比对分析，获得菌种的分类信息。经聚类分析比对正确后，同时得到环境微生物核酸序列库，用于分析和溯源。

2 结果与分析

2.1 环境微生物分布图建立

生产车间 B 级、C 级、D 级环境共 31 个房间和走廊中，共收集并鉴定到24 个种属的171 株微生物。生产车间A级环境控制良好，未收集到微生物。其中，葡萄球菌属和微球菌属是监控到的主要菌属，每个级别环境微生物鉴定结果见表2。可见，尽管B 级环境微生物很少，但B级环境与无菌生产的A级环境较接近，应高度重视B 级环境出现菌。C级环境中葡萄球菌属占比很高，几乎每个房间均含有；D 级环境也以葡萄球菌属（38.89%）、微球菌属（24.60%）为主，主要污染微生物还是人员污染菌，并以走廊、清洗室、烘干室及男女更衣室的种类较多。D级环境中126株微生物分布图见图1。

图1 生产车间D级环境不同区域微生物分布图Fig.1 Microbial distribution in different areas of level-D environment in a workshop

表2 生产车间环境监控微生物鉴定结果（n=171）Tab.2 Results of environmental microorganism identification in a workshop（n=171）

2.2 溯源分析

企业中试试验无菌检查样品中发现了阳性样品，经过16srRNA 分离鉴定为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus strain（菌种编号为2019085，2019088），与环境库中找到的7 株蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus strain（来源见表3）进行菌株水平的鉴定，以找到真正的污染源。

表3 环境中蜡样芽孢杆菌的来源Tab.3 Sources of Bacillus cereus strain in the environment

由于16srRNA 测序分析无法将蜡样芽孢杆菌分析到菌株水平，因此采用核糖体分型技术进行溯源分析。选用2 种限制性内切酶进行酶切，分型结果见图2。可见，用EcoRⅠ酶切后，9株菌聚类分析图谱很相近，基本都在0.95 以上，故此酶无法将这些污染微生物进行溯源分析，区分能力有限；用PvuⅡ酶切，9 株菌可被较好地聚类，样品污染菌2019085 和2019088 与数据库中的环境菌2019261 和2019291 聚类到一起，基本达到0.95的遗传距离，可认为带型一致，而其他菌的相似度低于0.7，应不是同源。故样品污染菌与环境菌2019261 和2019291 亲缘关系较近，中试样品中的污染微生物很可能来源于生产区B级脱无菌衣室（2019261）或质量控制实验室阳性间（2019291）。质量控制实验室阳性间的操作是在检验结束后，而无菌试验过程全程监控未发现异常，故在质量控制实验室污染的可能性不大。在生产区B 级脱无菌衣室发现的蜡样芽孢杆菌与产品生产非常接近，更可能为真正的污染源。

图2 蜡样芽孢杆菌EcoRⅠ和PvuⅡ酶切核糖体分型结果Fig.2 Results of ribotyping of Bacillus cereus strain by EcoRⅠ and Pvu Ⅱ

3 讨论

3.1 环境微生物数据库的建立

所建立的环境微生物数据库涵盖了生产的全过程。生产区是核心部分，主要对生产区进行了考察，其中葡萄球菌属是主要的污染菌，B 级、C 级、D 级分别占70.00%，51.43%，38.89%。可见，人员污染是环境污染的主要原因，与文献［5-8，10］结果相似。D级环境菌种类别相对较多，可能是采样时为了扩大采集范围增加了很多表面微生物的采集，因此收集到较多种类的微生物。质量控制实验室的监控主要为污染调查时应用，当出现污染事件时，要排除试验误差，客观掌握无菌环境中的微生物，才能很好地判定试验结果。

3.2 溯源分析方法

环境微生物数据库的主要作用之一是用于溯源分析，当出现污染或有可疑结果时，可通过数据库对可疑菌进行查询。环境微生物数据库一般是以基因库16srRNA 序列库为基础，结果的准确性全依靠16srRNA的准确性，受16srRNA 的局限性影响，部分菌种只能将菌鉴定属水平，无法进一步分析。对于环境微生物中风险不是很高的区域的微生物，鉴定到属水平可满足相关的监管需求［1-2］。当需要进行溯源分析时，再将污染微生物从菌种保藏管中取出，采用其他适宜的方法进行菌株水平鉴定［11-15］，如核糖体分型、多位点序列分型（MLST）、脉冲场电泳、看家基因和全基因组测序等。每种溯源分析方法针对不同的菌属均有不同优势，需通过实验具体分析。本研究中采用核糖分型方法对蜡样芽孢菌进行溯源分析，以及不同酶进行酶切，结果差异大。因此，溯源分析的实验人员须具有一定的经验和技巧。

3.3 风险评估

环境监控需要更多考虑到风险评估风险调查的数据，以及潜在的风险区域。本研究中D 级应当是个相对风险较低的区域，如果D 级区有A 级层流，就应加强重视，D 级区的菌是否可通过屏障带入A 级区域就需进行一定的风险调查。

3.4 无菌保障

环境微生物数据库的建立在企业生产中有很多应用［16］，主要用于为企业溯源分析提供依据。药品生产工艺复杂，生产步骤多，对于无菌药品更是对环境控制要求更高，一旦出现污染事件则调查难度大。随着监管和数据完整性要求的加大，建立环境微生物数据库将成为无菌保障的重要手段，溯源分析能力将成为企业风险管理的重要能力。