LINC00221通过激活ERK信号通路促进肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭

张玉萍 宋蕾 李春艳 程晓磊 孙国锋

肝细胞癌(HCC)的发生和发展的分子机制仍不清楚[1]。长链非编码RNA(LncRNA)通过表观遗传发挥基因的转录调控功能，其异常表达与癌症发展中多种病理过程密切相关[2]。长间隔非编码RNA 00221(long intergenic non-coding RNA 00221，LINC00221)是一种新发现的LncRNA，其表达上调与肌层浸润性膀胱癌进展相关，增强非小细胞肺癌的顺铂耐药性，影响治疗和预后[3]。有学者通过整合分析发现,LINC00221与HCC病人生存期密切相关，是HCC的预后生物标志物[4]。本研究探讨干扰LINC00221表达对HCC细胞增殖、迁移和侵袭生物学行为的影响。

材料与方法

一、试验试剂

肝上皮细胞LO2和HCC细胞株HCCLM6、Hep3B、MHCC-97H、Huh-7、MHCC-LM3均由本院实验中心冻存。干扰片段siRNA-LINC00221和阴性对照siRNA-NC购自上海吉玛制药技术有限公司；转染试剂Lipofectamine® 3000购自美国Thermo Fisher公司；RPIM1640培养基、PBS和胰蛋白酶购自美国Gibco公司；ERK信号激动剂C16-PAF购自美国MCE公司。LINC00221干扰序列1：F：AGAAUCAUAUGCAAACAGCCU；R：GCUGUUUGCAUAUGAUUCUUC。LINC00221干扰序列2：F：AGAAGAAUCAUAUGCAAACAG；R：GUUUGCAUAUGAUUCUUCUAA。

二、方法

1.细胞处理：向细胞中加入含有10%胎牛血清及1%双抗的RPIM1640培养基于37 ℃，5% CO2恒温培养箱培养，待细胞长满后用0.25%胰蛋白酶进行消化传代。使用Lipofectamine® 3000分别将siRNA-LINC00221和siRNA-NC转染到MHCC-LM3细胞，实验分组为空白对照组、阴性对照组、LINC00221干扰组(转染siRNA-LINC00221)、LINC00221干扰+ERK激动剂组(转染siRNA-LINC00221+C16-PAF)。

2.CCK-8实验：转染处理的第0小时、24小时、48小时、72小时，向细胞中加入5 μl的CCK-8溶液孵育4小时，通过酶标仪测定450 nm波长下OD值，计算MHCC-LM3细胞活力。

3.细胞划痕实验：细胞长满后，使用10 μl枪头向单层细胞划线，宽度控制在500 μm左右，显微镜拍照并记为0小时结果。继续培养24小时后用显微镜拍照，计算MHCC-LM3细胞24 h内划痕愈合率。

4.Transwell实验：Transwell小室底部基底膜加入100 μl基质胶稀释液，风干后加入100 μl的培养基。小室外加入含10%胎牛血清培养液900 μl，重悬MHCC-LM3细胞至浓度1×105/ml，接种细胞到小室内并孵育24小时。取出小室，用4%浓度多聚甲醛固定30分钟以上；结晶紫工作染液染色30分钟以上，光学显微镜照相，统计分析MHCC-LM3细胞穿膜数量。

5.qRT-PCR实验：去除培养基后，加入800 μl的Trizol试剂充分裂解细胞，加入200 μl氯仿4 ℃离心提取细胞总RNA。取1 μg RNA，逆转录合成cDNA，并以cDNA为模板定量PCR检测。GAPDH作为内参，2-ΔΔCt法计算LINC00221的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

6.Western blot检测：转染处理48小时后向细胞中加入200 μl蛋白裂解液冰上裂解30分钟，12 000 g冷冻离心提取细胞总蛋白。取蛋白样本加入4 SDS上样缓冲液，混匀后煮沸变性10分钟，进行SDS-PAGE电泳，经过转膜后置于5%的BSA封闭1～2小时，4 ℃过夜孵育一抗，室温1小时孵育二抗，ECL避光显影、拍照。以GAPDH为内参分析目标分子蛋白相对表达量，p-ERK1/2表达为p-ERK1/2与ERK1/2光密度比值。

三、统计学方法

结果

1.LINC00221在HCC细胞中表达上调：LINC00221在HCC细胞HCCLM6(1.383±0.074)、Hep3B(1.432±0.100)、MHCC-97H(1.632±0.055)、Huh-7(1.640±0.106)、MHCC-LM3(1.982±0.096)中表达水平高于正常肝上皮细胞LO2(1.000±0.058),差异有统计学意义(P<0.05)。

2.HCC细胞中LINC00221的表达：空白对照组(1.000±0.057)和阴性对照组(0.964±0.048)中LINC00221相对表达水平差异无统计学意义；转染LINC00221干扰序列1组(0.398±0.010，P<0.01)以及LINC00221干扰序列2组(0.285±0.025，P<0.01)LINC00221相对表达水平低于阴性对照组。说明siRNA-LINC00221转染成功，后续体外功能验证试验将转染LINC00221干扰序列2处理MHCC-LM3细胞。

3.LINC00221介导ERK信号通路对HCC细胞增殖的影响：空白对照组和阴性对照组MHCC-LM3细胞活力差异无统计学意义。LINC00221干扰组MHCC-LM3细胞活力低于阴性对照组，(P<0.01)；LINC00221干扰+ERK信号激动剂组MHCC-LM3细胞活力高于LINC00221干扰组(P<0.01)，见图1。

图1 干扰LINC00221对MHCC-LM3细胞增殖能力的影响

4.LINC00221介导ERK信号通路对HCC细胞迁移的影响：空白对照组(62.070±1.711)和阴性对照组(65.610±1.884)细胞划痕愈合率差异无统计学意义；LINC00221干扰组MHCC-LM3细胞划痕愈合率低于阴性对照组(38.790±2.899)；LINC00221干扰+ERK信号激动剂组MHCC-LM3细胞划痕愈合率高于LINC00221干扰组(66.387±2.799，差异有统计学意义P<0.01)。见图2。

图2 干扰LINC00221对MHCC-LM3细胞迁移能力的影响(放大倍数100倍)

5.LINC00221介导ERK信号通路对HCC细胞侵袭的影响：空白对照组(171.667±3.283)和阴性对照组(183.333±8.413)穿膜细胞数量比较差异无统计学意义；LINC00221干扰组穿膜细胞数量低于阴性对照组(97.000±4.726)；LINC00221干扰+ERK信号激动剂组穿膜细胞数量高于LINC00221干扰组(162.667±4.485)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 干扰LINC00221对MHCC-LM3细胞侵袭能力的影响(放大倍数100倍)

6.LINC00221对HCC细胞中ERK信号通路的影响：空白对照组和阴性对照组MHCC-LM3细胞中MEK1/2和p-ERK1/2表达差异均无统计学意义；LINC00221干扰组MHCC-LM3细胞中MEK1/2和p-ERK1/2表达水平低于阴性对照组；LINC00221干扰+ERK信号激动剂组MHCC-LM3细胞中MEK1/2和p-ERK1/2表达水平高于LINC00221干扰组，差异有统计学意义P<0.05(P<0.01)。见图4。

讨论

有研究显示，lncRNA调控肿瘤细胞的多种恶性行为[2]。如在HCC中发现DLX6-AS1通过靶向调节miR-513c/Cul4A/ANXA10轴促进HCC生长[5]。HCC中低表达的NBR2提示HCC病人预后更差、恶性程度更高，可以通过ERK和JNK通路抑制Beclin 1依赖的细胞保护性自噬发生，抑制HCC细胞增殖[6]。lncRNA-POIR通过分泌miR-182-5p促进细胞上皮间质转化，抑制索拉非尼敏感性[7]。

有研究发现，LINC00221在乳腺癌组织中表达是正常乳腺组织的2.1倍，与6种miRNAs存在靶向调控关系，介导下游靶mRNA差异表达[8]；另外LINC00221还与胃癌预后不良有关[9]。有研究团队分析TCGA数据发现HCC组织中LINC00221过度表达，其高表达病人术后生存期更短，并可能与Hsa-miR-182和hsa-miR-96竞争作用[4,10]。然而，尚不清楚LINC00221表达失调是HCC诱发因素或仅是HCC预后标志。本研究首先检测正常肝上皮细胞和HCC细胞株中LINC00221的表达，结果显示，LINC00221在HCC细胞表达异常上调。我们在MHCC-LM3细胞转染si-LINC00221干扰序列，检测差异表达LINC00221对MHCC-LM3细胞增殖、迁移和侵袭过程的影响，在细胞水平进行功能验证。结果显示，干扰LINC00221表达MHCC-LM3细胞增殖活力降低，同时细胞的迁移侵袭能力均明显减弱。以上结果提示，在HCC细胞中高表达的LINC00221可能通过促进细胞增殖、迁移和侵袭，加速HCC恶性发展，但其作用机制尚不清楚。

aP<0.01；1代表空白对照组、2代表阴性对照组、3代表LINC00221干扰组、4代表LINC00221干扰+ERK信号激动剂组图4 LINC00221对MHCC-LM3细胞中MEK1/2和p-ERK1/2表达的影响

ERK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为一种信号转导蛋白可传递有丝分裂原信号，定位于细胞质。激活的ERK被转移到细胞核，调节转录因子活性并产生细胞效应。ERK家族包括5个亚家族ERK1～5，其中ERK1和ERK2参与调节不同的细胞生理过程[11]。激活的ERK信号通路促进了多种癌症的发生和发展，参与细胞增殖、分化、凋亡、转移和耐药调控[12]。在HCC中，多种lncRNAs通过ERK信号影响癌症进程。HOXD-AS1激活MEK/ERK信号加速HCC细胞周期进程[13]。ZFAS1通过miR-624/MDK/ERK/JNK/P38信号通路影响HCC发展[14]。本研究发现，干扰LINC00221表达后MHCC-LM3细胞中MEK1/2和p-ERK1/2表达减少，因此推测，LINC00221影响HCC细胞表型可能与ERK信号通路有关。我们干扰LINC00221同时加入ERK信号激动剂，发现ERK信号激动剂处理明显逆转了LINC00221干扰对MHCC-LM3细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，说明LINC00221通过激活ERK信号，促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭生物学过程，发挥癌基因作用。ERK信号调控网络十分复杂，LINC00221如何通过间接或直接作用机制诱导ERK活化尚不清楚。我们将进一步研究LINC00221是否能够通过ceRNA等机制调控ERK信号轴，影响HCC恶性病变进展。