B细胞在骨破坏性疾病中作用的研究进展

张滨婧，张璟岚，张辰玥，陈艺菲，胡芝爱

骨骼在整个生命过程中不断地更新和重建，通过成骨细胞(osteoblast，OB)介导的骨形成和破骨细胞(osteoclast，OC)介导的骨吸收共同调控，骨重建中骨量达到动态平衡，实现骨稳态[1]。

Arron等[2]在2000年首次提出“骨免疫学”这一概念，强调免疫细胞可在炎症条件下调节OC生成。更多证据表明，免疫系统在生理和病理条件下均会影响骨稳态。此外，骨骼系统也会调节免疫细胞的发育。骨骼系统和免疫系统之间的相互调节作用受到广泛关注。

以往研究中，T细胞在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)[3]和牙周炎[4]等骨破坏性疾病中的作用已有广泛报道。B细胞作为特异性免疫中的另一重要组成部分，也可通过表达核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin，OPG)等细胞因子，分泌抗体等方式直接或间接地影响OC和OB功能调节骨稳态，在骨破坏性疾病的发生发展中起关键作用。

1 骨髓微环境对B细胞发育的调节

1.1 细胞因子

B细胞来源于骨髓中的多能造血干细胞，经过共同淋巴祖细胞、Pre-Pro-B细胞、Pro-B细胞、Pre-B细胞、未成熟B细胞和成熟B细胞阶段后，最后分化为浆细胞。骨髓微环境为B细胞发育提供了一系列重要因子，如趋化因子C-X-C基元配体12(chemokine C-X-C motif ligand 12，CXCL12)、白细胞介素(interleukin，IL)-7、RANKL、OPG、干细胞因子(stem cell factor，SCF)、活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1)和FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3，FLT3)等[5]。

C-X-C趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4)是CXCL12主要受体，CXCL12-CXCR4轴是调控骨髓中B细胞祖细胞(B-lymphoid progenitor，BLP)功能的主要途径[6]。Minami等[7]发现B淋巴前体细胞表达的CXCR4与基质细胞表达的CXCL12结合能诱导B淋巴前体细胞向Pro-B细胞分化。然而，当Pre-B细胞分化为未成熟和成熟B细胞时，B细胞对CXCL12的反应性降低，但CXCR4在细胞表面的表达并未改变。而当B细胞分化为浆细胞后，又重新恢复了对CXCL12的敏感度[8]。这种B细胞短暂地对CXCL12反应性丧失的机制目前尚未明确。有研究表明趋化因子受体7(C-C chemokine receptor type 7，CCR7)在Pre-B细胞向未成熟和成熟阶段分化的过程中明显上调[9]。McHeik等[10]证明CCR7通过抑制CXCR4介导的G蛋白抑制性α亚单位(inhibitory α subunits of G proteins ，Gαi)1蛋白和Gαi2蛋白活化从而抑制CXCR4的功能，CCR7缺乏的小鼠成熟B细胞表现出对CXCL12更高的反应性，CCR7在调节B细胞发育过程中的作用也不容忽视。

在早期B细胞发育过程中，IL-7和IL-7受体缺乏的小鼠表现出B细胞数量的明显减少[11]。IL-7可以通过诱导髓样细胞白血病蛋白-1(myeloidcellleukemia-1，MCL-1)的表达提高BLP的存活率[12]。在Pro-B细胞期，IL-7与IL-7受体结合，IL-7受体激活JAK1/3，继而激活Stat5a/b，Stat5转位到细胞核并激活多种基因转录从而促进B细胞的存活和增殖。IL-7受体还通过PLCγ/DAG/PKC信号通路激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)从而调控B细胞的生成[13]。而在Pre-B细胞期，一方面Pre-B细胞的发育依赖于IL-7受体信号和前B细胞抗原受体(pre B-cell receptor，PreBCR)信号，但依赖程度低于Pro-B细胞[14]；另一方面，IL-7受体信号又通过抑制Rag基因和Ig轻链基因的表达来阻止Pre-B细胞的发育[15]。目前尚不清楚IL-7受体信号的双重作用是如何实现平衡的。Fistonich等[16]最近提出PreBCR信号可以通过增加CXCR4、降低黏着斑激酶的表达，减少Pre-B细胞与骨髓中的IL-7+细胞的接触，进而减弱了IL-7受体信号转导。

骨髓微环境中的其他细胞因子对B细胞发育也有重要影响。RANKL缺失小鼠的Pro-B细胞向Pre-B细胞转变过程明显阻滞，将正常表达RANKL的造血细胞前体细胞移植到RANKL缺乏的小鼠体内后发现B细胞可以正常发育[17]；OPG可能与B细胞的激活有关，在OPG敲除小鼠和OPG过表达小鼠中，B细胞发育似乎没有影响，但B细胞对T细胞依赖性抗原的免疫反应减弱[18]；表达膜结合性SCF的细胞能促进Pre-B细胞向Pro-B细胞转变[19]；NFATc1活性缺失会抑制早期B细胞因子1(early B-cell factor1，EBF1)(早期B细胞发展中表达的一种重要转录因子)的表达，损害Ig基因重排，影响Pre-BCR的形成，从而阻止Pro-B细胞向Pre-B细胞转变，导致严重的B细胞减少[20]；FLT3配体缺乏的小鼠骨髓中BLP严重降低[21]。

1.2 相关细胞

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是由中胚层发育而来的骨髓非造血干细胞，可以进一步分化骨祖细胞、OB和成熟的骨细胞(osteocyte，OCY)。

BMSCs在B细胞的增殖和分化中起着重要作用。研究表明BMSCs中CXCL12的缺失会导致BLP的消失。Yee等[22]认为BMSCs中的骨硬化蛋白(sclerostin，SOST)的缺失会导致CXCL12降低，进而影响B细胞成熟后期IgM和IgG的上调。但还需进一步的研究来确定在SOST缺失的条件下，CXCL12及调节其表达的Wnt信号是否有变化。

OB也可以影响骨髓中B细胞的发育。OB已被证明能够支持B细胞从造血干细胞发育成IgM+B细胞[23]。Martin等[24]和Wang等[25]都证明OB通过mTORC1信号调节B细胞从Pro-B细胞到Pre-B细胞的发育，且mTORC1信号来源的是前OB，而不是成熟的OB。

OC在B细胞的发育也发挥重要作用。Mansour等[26]发现当OC功能受损时，B细胞发育停滞在Pro-B细胞向Pre-B细胞发育的阶段。体外研究也表明将人浆细胞和OC共培养后，人浆细胞的存活率提高[27]。

目前关于骨髓微环境对B细胞发育的研究大多基于小鼠体内，但人类和小鼠B细胞发育的所需条件可能不尽完全相同，仍有待进一步研究。

2 B细胞调节骨稳态的机制

B细胞主要通过RANKL/RANK/OPG轴调节骨稳态。正常生理情况中，在T细胞共刺激信号的调控下，B细胞是骨微环境中OPG的主要来源(OPG产量浆细胞>成熟B细胞>B细胞前体、未成熟B细胞)。OPG通过与RANK竞争RANKL的结合位点，从而抑制RANKL介导的OC分化和激活[28]。但Cawley等[29]研究结果相反，他们发现用CD19-Cre删除B细胞的OPG并不会影响小鼠的股骨或脊柱的皮质厚度和松质骨体积。

在炎症条件下，B细胞可以通过高表达RANKL与OC前体细胞结合，同时下调OPG，诱导OC分化[30]。尽管B细胞来源的OPG对骨丢失有一定的保护作用，但是B细胞表达的RANKL和T细胞来源的细胞因子对骨的破坏作用更占优势。

除此以外，B细胞还可通过其他方式影响骨稳态。B细胞表达B细胞淋巴瘤因子6(B-cell lymphoma 6，Bcl-6)，Bcl-6通过结合NFATc1靶基因的启动子区域，阻断NFATc1的转录活性[31]。NFATc1是OC分化的主要调控因子。NFATc1与MITF、c-Fos和PU.1等转录因子联合，通过诱导组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶9、酒石酸耐酸酸性磷酸酶和ATP酶H+转运V0亚单位D2调控OC融合和骨吸收。

另外，在炎症条件下B细胞可以分泌破骨细胞生成因子(secreted osteoclastogenic factor of activated T cells，SOFAT)。SOFAT是活化T细胞分泌的一种细胞因子，能以非RANKL依赖的方式诱导OC骨吸收[32]。

B细胞本身可能转分化为OC。已有研究表明，骨髓B细胞能发生非典型的OC生成[33]，但是这种看法还存在争议，因为无法完全排除分离的B细胞培养物中依然残留有单核细胞的可能，同时也缺乏体内研究的证据。Deshet-Unger等[34]的最新研究利用谱系追踪的方法证明了促红细胞生成素在体内能够刺激表达集落刺激因子-1受体(colony-stimulating factor-1receptor，CSF-1R)/CD115的Pro-B细胞转分化为OC，但依旧不能完全排除散在单核细胞存在的可能性。因此，在排除单核细胞的存在下，Pro-B细胞能否分化为OC，在未来还有待进一步的研究。

3 B细胞与骨破坏性疾病

3.1 B细胞与RA

RA是一类自身免疫性疾病，以关节滑膜炎症为特征，常导致关节局部骨侵蚀、关节周围骨丢失乃至全身性骨质疏松症。其发病机制复杂，之前的研究表明RA导致的骨损伤与滑膜细胞、Th17细胞和骨髓基质细胞激活OC有关[35]，近年来的研究也发现B细胞在RA的骨侵蚀中起着关键作用。

B细胞可能受到刺激后增殖分化成浆细胞产生自身抗体导致RA患者骨损伤。Engdahl等[36]在小鼠关节腔内注射突变瓜氨酸波形蛋白(mutated citrullinated vimentin，MCV)，发现关节滑膜组织和周围骨髓腔中的浆细胞会分泌大量的抗MCV抗体。抗MCV抗体是RA的标志，能结合Fc受体激活下游的syk通路促进局部OC产生和活化，导致关节周围的早期骨丢失。

进一步研究发现瓜氨酸蛋白/肽(citrullinated protein/peptide，CP)反应性B细胞除了表达IL-7受体和C5a受体之外，还表达共刺激分子CD40，并通过B细胞抗原受体特异性识别并内吞抗原，具有抗原提呈和活化T细胞的能力[37]。Mahendra等[38]从RA患者外周血提取了环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)特异性B细胞，发现TNF-α、IL-6、CCL5和CXCR4表达均上调，通过分泌双调蛋白(amphiregulin，AREG)诱导成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)的迁移和增殖，而FLS的激活是RA发病的标志之一。

此外，B细胞常存在于RA患者的关节滑膜组织中，以RANKL依赖的方式促进OC生成，同时通过高表达CCL3和TNF抑制OB成骨分化[39-41]。

综上，B细胞在RA骨损伤的作用可能有以下4点：①产生自身抗体直接促进OC分化；②作为抗原提呈细胞激活T细胞间接影响骨稳态；③分泌细胞因子如IL-6、TNF和AREG等，直接激活OC或者通过调控其他细胞如成纤维样滑膜细胞间接调节骨损伤[42]；④表达RANKL直接影响OC和OB功能。

3.2 B细胞与牙周炎

牙周炎以牙周支持组织炎性破坏为特征，临床表现为牙龈出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收、附着丧失以及牙齿松动和移位。B细胞在牙周炎牙槽骨骨稳态维持中具有多重作用。

健康牙龈结合上皮根部附近的结缔组织中存在CD19+CD27+记忆B细胞。牙周炎组织中的B细胞主要为CD19+CD27+CD38+CD138+HLA-DRlow浆细胞，聚集在牙周袋底部病变边缘的牙周结缔组织中[43]。Mahanonda等[43]发现在健康牙龈组织和牙周炎组织中浆细胞所占的比例都是最大的。这些浆细胞会分泌针对牙周病原体(如牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌等)的IgG和IgA，进一步形成免疫复合物激活补体经典途径和中性粒细胞而导致牙周组织破坏。

B细胞也可以通过分泌促炎细胞因子间接影响牙槽骨吸收。Han等[44]发现将牙周炎大鼠牙龈中的致敏记忆B细胞注射到大鼠体内，会导致牙周组织中TNF-α、IL-1β和IL-17A表达增加，促进局部炎症，引起牙槽骨吸收。

Jarry等[45]还证明了牙周炎患者牙龈组织中的成熟B细胞和浆细胞是SOFAT的主要来源。SOFAT的存在会加重炎症反应，促进OC的形成和骨质破坏，在牙周疾病中发挥重要作用。

此外，B细胞还通过表达RANKL直接调控OC分化从而调节牙槽骨的动态平衡。Mahanonda等[43]在牙周炎组织中的浆细胞表面和细胞内均检测到RANKL。Han等[44]证实了牙周炎期间牙龈内记忆B细胞通过产生RANKL直接促进了OC生成从而导致牙槽骨吸收。

除了传统的B2细胞外，B1细胞在牙周炎期间也表现出诱导牙槽骨吸收的潜力。口腔感染导致IL-33表达增加，IL-33介导的B1细胞可以招募单核细胞和粒细胞并产生RANKL[46]，还能在RANKL和M-CSF存在的条件下分化为破骨细胞样细胞。

有研究表明牙周炎中的B细胞受到自噬的调控。牙周炎组织中自噬基因EDEM1越高，B细胞的激活程度越高[47]。牙周病原体可以触发自噬来消灭微生物，而自噬又可以通过影响B细胞功能来调节炎症的程度。

作为调节性B细胞(regulatory B cells，Bregs)亚群之一的B10细胞，可产生抗炎细胞因子IL-10，其在健康的牙周组织中很少存在，但在牙周炎小鼠的牙周组织中能够检测到[48]。Wang等[49]发现牙龈卟啉单胞菌脂多糖可以使小鼠脾脏中富含B10细胞的 CD1dhiCD5+B细胞亚群增加，进一步过继转移CD1dhiCD5+B细胞能观察到实验性牙周炎小鼠牙龈组织中B10细胞的数量增加，进而促进IL-10的表达，抑制RANKL、TNF-α和IL-1α的表达，减缓牙周炎症，减少牙槽骨丢失[50]。

但是在炎症条件下机体产生的B10细胞不足以抑制疾病的进展，此时其他促炎细胞因子更占优势。目前B10细胞主要通过过继细胞转移治疗疾病，但是这也面临着高成本和高耗时等问题以及全身使用可能会导致严重的不良事件(如细胞因子释放综合征)。

3.3 B细胞与骨质疏松症

雌激素缺乏是女性绝经后骨质疏松症的主要原因之一，其可导致B细胞表达的RANKL增加，造成骨丢失。RANKL由Tnfs11基因编码，敲除B细胞Tnfsf11基因可以防止雌激素缺乏导致的OC增加和松质骨丢失。雌激素主要通过雌激素受体α(ERα)调节B细胞的功能[51]。ESR1是一种编码ERα的基因，它和丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)共同参与雌激素受体信号转导。在B细胞中，ESR1和MAPK3刺激MECP2的表达，MECP2可抑制RANKL表达。而当雌激素缺乏时，B细胞中的ESR1和MAPK3表达下调，MECP2表达降低[52]，进而导致RANKL表达增高。

雌激素缺乏还会引起B细胞数量增加：一方面，雌激素缺乏直接诱导OB产生IL-7和CXCL-12等细胞因子[53]进而促进B细胞增殖；另一方面，雌激素还能通过上调OCY表达的RANKL间接地增加B细胞数量[54]。B细胞数量增加会将更多的RANKL引入体内，从而导致异常的骨吸收。此外，雌激素缺乏还会导致B细胞分泌粒细胞集落刺激因子增加，促进OC前体细胞的增殖[55]。

3.4 B细胞与其他感染性疾病

一些细菌、病毒或者寄生虫感染会引起异常的骨丢失，导致骨质疏松症或病理性骨折等，与B细胞表达RANKL和OPG失衡导致OC骨吸收增强。

HIV被认为是骨质减少和骨质疏松的重要危险因素[56]。HIV感染导致的骨丢失常可归因于感染引起的免疫功能障碍。在HIV感染者中，表达OPG的记忆B细胞比例降低，而表达RANKL的记忆B细胞比例增高，导致RANKL/OPG比值升高，有利于OC骨吸收[57-58]。

血吸虫感染中，RANKL主要由CD4+T细胞和B细胞表达。RANKL表达升高和OPG表达降低与血吸虫感染导致的骨丢失有关[59]。

4 结 语

综上所述，骨骼系统在B细胞发育过程中起着不可或缺的作用，同时B细胞也影响着骨稳态。然而，目前关于骨髓微环境对B细胞发育的具体作用及B细胞与骨破坏性疾病的研究较为局限，更深入的机制还需进一步的探讨。通过改变骨破坏性疾病中B细胞及其亚群的表达水平，调控B细胞作用于骨骼系统的相关基因和信号通路，从而调节骨稳态可能成为未来治疗骨破坏性疾病的新方向。明确B细胞与骨稳态之间的相互作用，对了解骨破坏性疾病的发生发展有着重要意义，有助于为骨破坏性疾病的研究和治疗提供新的思路。