2型糖尿病相关差异甲基化基因的全基因组关联研究进展▲

苏银霞 姚 华

(新疆医科大学1 医学工程技术学院，2 健康管理中心，新疆乌鲁木齐市 830000)

【提要】 2型糖尿病(T2DM)是致残、致死的主要疾病之一，其生物学发病早于临床症状的出现。因此，近年来与T2DM早期诊断生物标志物的相关研究明显增多。这些生物标志物对于制定个性化的干预措施以预防或延缓T2DM进展有着重要的意义。表观遗传修饰是基因、环境和生活方式之间的纽带，越来越多的证据表明，在T2DM的发病机制中DNA甲基化是最具特征、研究最为广泛的表观遗传机制。本文对差异甲基化基因作为T2DM生物标志物的全基因组关联研究的进展进行综述。

糖尿病是全球范围内致残、致死的主要疾病之一，据统计，2021年全球约有5.36亿人罹患糖尿病，预计到2045年糖尿病患者数量将增至7.83亿人[1]。90%以上的糖尿病患者为2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，随着肥胖和胰岛素抵抗者数量的不断攀升，T2DM的发病率在全球范围内不断增高[2-3]。T2DM早期阶段可因毫无症状而被忽视，但在此期间微血管、大血管并发症可能已经发生[4]。因此，寻找可靠、敏感和容易获得的T2DM生物标志物有助于患者的早期诊断、治疗和管理。胰岛素靶器官的表观遗传变化可以反映在血液中，因此血液中的DNA甲基化可能与T2DM的发生相关，相关差异甲基化基因可以作为T2DM潜在的候选生物标志物[4-5]。随着人类基因组学相关技术的进步，表观遗传学研究的重点已经从候选基因的研究转移至高通量、全基因组关联研究(epigenome-wide association study，EWAS)。近年来，随着微阵列芯片和甲基化测序等技术的广泛应用，人们对与T2DM相关的DNA甲基化有了更深入的了解。本文对T2DM相关差异甲基化基因的EWAS进展进行综述。

1 基于微阵列芯片甲基化分析发现的T2DM相关差异甲基化基因

基于微阵列芯片的甲基化分析是通过比较DNA样本在被甲基化敏感性限制内切酶消化前后与该内切酶的杂交强度的比值，来定量DNA样本的甲基化水平[6-7]，是最早用于分析T2DM相关全基因组甲基化改变的EWAS技术[8]。Toperoff等[9]基于微阵列芯片技术比较了710例T2DM患者和459例健康人的外周血DNA甲基化水平，发现两者的差异甲基化位点在已证实的T2DM相关易感基因中富集，其中差异性最显著的甲基化位点位于以下基因：溶质载体家族30成员8(solute carrier family 30,member 8,SLC30A8)、转录因子7类似物2(transcription factor 7-like 2，TCF7L2)、脂肪质量和肥胖相关(fat mass and obesity-associated，FTO)基因、钾通道蛋白1(potassium voltage-gated channel subfamily Q member 1，KCNQ1)基因、甲状腺腺瘤相关基因及邻接锌指基因1。随后，他们通过亚硫酸氢盐测序法进一步分析发现，FTO基因第一个内含子CpG位点的低甲基化水平与T2DM发病风险相关。这一结果与一项基于耶路撒冷青年人群样本采用焦磷酸测序法的队列研究结论一致，其中FTO第一内含子CpG位点呈低甲基化的青年后来发展为T2DM患者[10]。上述研究结果表明，呈低甲基化的特定基因位点可能是反映T2DM发病风险的早期标志物之一。

2 基于微珠阵列芯片甲基化分析发现的T2DM相关差异甲基化基因

基于微珠阵列芯片的DNA甲基化分析，旨在为多个样本中特定的胞嘧啶提供单碱基分辨率分析和定量评价[11]。Infinium芯片是由Illumina公司研发的人甲基化芯片，可检测超过485 000个甲基化位点，覆盖了96%的CpG岛(即CpG的高聚集状态)及CpG岛岸(即CpG岛两侧的2 kb区域)[12]。Chambers等[13]使用人甲基化450 微珠阵列芯片分析了印度亚裔人和欧洲人外周全血中与T2DM相关的DNA甲基化，并对其进行随访，在最终发展为T2DM的患者中发现了差异甲基化的CpG位点，这些位点存在于包括已知的T2DM相关基因，如TCF7L2、FTO和KCNQ1；此外，该研究还发现CpG硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)、磷酸腺苷盒式亚家族G成员1(ATP-binding cassette subfamily G member 1，ABCG1)、磷酸乙醇胺/胆碱磷酸磷酸酶1(phosphoethanolamine/phosphocholine phosphatase 1，PHOSPHO1)、抑制细胞因子信号3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)、固醇调节元件结合转录因子1(sterol regulatory element binding transcription factor 1,SREBF1)的相关位点甲基化与T2DM的发生相关，这5个基因相关位点的联合甲基化评分是T2DM发生的危险因素，且独立于已证实的T2DM危险因素，如T2DM家族史、体育活动、体质指数、腰臀比、糖化血红蛋白水平、葡萄糖和胰岛素浓度等。

随后，Dayeh等[14]应用Infinium芯片评估了Chambers等[13]确定的位点，证实了全血DNA中ABCG1、PHOSPHO1基因相关位点的甲基化水平与T2DM患病风险之间存在关联，而SOCS3、SREBF1或TXNIP基因相关位点甲基化水平与T2DM无关，且ABCG1基因相关位点甲基化水平与HbA1c和空腹胰岛素水平呈正相关，而PHOSPHO1基因相关位点甲基化水平与HDL水平呈正相关，其高甲基化水平与T2DM的发病风险降低相关。ABCG1基因相关位点甲基化水平与空腹血糖和胰岛素水平之间的关系，在另外3项应用微珠阵列芯片进行甲基化分析的研究[15-17]中也得到印证。此外，有研究表明，ABCG1基因编码ATP结合盒转运蛋白超家族成员1，该蛋白参与巨噬细胞的胆固醇和磷脂转运，并可能调节其他类型细胞的脂质稳态[18]。由于胆固醇异常是T2DM发病的危险因素，因此推测ABCG1基因的高甲基化水平可能使胆固醇循环浓度异常，从而影响T2DM的发病和进展，以及T2DM心血管并发症的发生风险[18]。

Al Muftah等[19]应用Infinium芯片研究123例阿拉伯受试者的全血DNA甲基化水平，并验证了8个与T2DM患病风险相关的基因CpG位点，其中包括上文提到的TXNIP基因，在T2DM患者中TXNIP基因甲基化呈低水平，与相关研究结果[20]相似。TXNIP的表达是由葡萄糖来诱导的，因此TXNIP基因呈低甲基化状态说明TXNIP基因过表达，已有相关动物实验和临床研究表明，在糖尿病动物和患者中TXNIP基因呈过表达[20-23]。此外，TXNIP还可通过抑制血管内皮生长因子来调节血管生成的能力，从而参与T2DM相关血管并发症的发展[23]。Al Muftah等[19]在阿拉伯人群中还发现在一个与T2DM相关的新位点，即DEAQ框肽1(RNA依赖ATP酶)基因的一个CpG位点，其甲基化水平与T2DM的患病风险相关。DEAQ框肽1(RNA依赖ATP酶)是编码一种ATP依赖性RNA螺旋酶的基因。该酶在肝脏和肌肉中高度表达，但其在T2DM中的作用仍有待探索[24]。

Kulkarni等[17]应用Infinium芯片分析850例墨西哥裔美国人外周血中446 356个位点的DNA甲基化情况，发现了51个与T2DM发病显著相关的差异性甲基化CpG位点，其中19个与空腹血糖水平相关，24个与胰岛素抵抗指数相关，而与T2DM相关性最强的5个CpG位点位于3个基因上，包括前述的TXNIP和ABCG1基因，以及不育结构域12基因(sterile alpha motif domain containing 12,SAMD12)。SAMD12基因已被确定为乳腺癌基因的融合靶点[25]，但其在T2DM发病中的作用仍有待探索。

Jeon等[26]基于韩国人群，开展了一项为期10年的T2DM队列研究和一项非T2DM和T2DM的横断面研究，探讨外周血全基因组DNA甲基化水平改变与T2DM患者葡萄糖稳态的关系，队列研究采用Illumina芯片分析，随后在横断面研究中采用靶向焦磷酸测序法加以验证；结果显示，在外周全血和胰岛细胞中均找到了382个差异甲基化位点，其中有3个位点与T2DM相关，这些位点由Musashi RNA结合蛋白2基因(Musashi RNA-binding protein 2，MSI2)和CXXC型锌指蛋白4基因编码，MSI2编码的位点位于chr17:55484635区域，该位点与T2DM特征性指标胰岛素敏感指数和胰岛素抵抗指数的相关性最强。而早在2011年，Szabat等[27]即发现脂肪毒性和内质网应激可上调MSI2的表达，而小鼠胰腺β细胞中MSI2的表达变化可显著改变胰岛素的表达，提示MSI2可能参与T2DM的发病，Jeon等[26]的研究结果进一步印证该结论。

3 基于免疫沉淀反应甲基化测序发现的T2DM相关差异甲基化基因

DNA甲基化免疫沉淀测序法是一种通用的、无偏倚的检测DNA甲基化的方法，其使用一种可特异性识别5-甲基胞嘧啶的单克隆抗体来检测DNA甲基化的富集情况，然后通过大规模测序分析免疫沉淀片段[28]。由于这种方法不需要进行亚硫酸氢盐转换，且能够区分5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶即5-甲基胞嘧啶的氧化产物，因此非常高效[28]。Liu等[29]采用了DNA甲基化免疫测序法研究ABCG1基因cg06500161位点甲基化在他汀类药物增加T2DM发病风险方面的作用，发现ABCG1基因cg06500161位点甲基化水平与T2DM相关指标(空腹血糖和胰岛素)呈正相关。其采用两步孟德尔随机化法证实了他汀类药物对T2DM患病风险的影响是通过表观遗传机制实现的，特别是ABCG1基因cg06500161位点甲基化水平的改变增加了T2DM风险，并发现ABCG1基因甲基化位点cg06500161是他汀类药物与T2DM风险之间联系的媒介，为T2DM的预测和预防策略提供了新的思路。此外， Qie等[30]在中国洛阳市20 194例受试者中开展了为期6年的巢式队列研究，最终匹配了286对非T2DM与T2DM受试者，通过DNA甲基化免疫沉淀测序法分析了ABCG1基因甲基化及其动态变化与T2DM发病的关系；结果显示，CpG13和CpG14的甲基化水平及CpG15位点的甲基化增益率与T2DM的发病风险呈正相关。由此可见，ABCG1基因甲基化及其动态变化可用于预测T2DM的发病风险，有助于早期干预方案的制定。

Yuan等[31]采用高通量全基因组DNA甲基化免疫沉淀测序法检测了27对同卵双胞胎的全血表观DNA甲基化水平，发现 与T2DM相关性最高的甲基化位点是黏液相关淋巴组织淋巴瘤易位蛋白1(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1,MALT1)基因的两个部分区域重合的甲基化位点(chr18:56336501-56337000和chr18:56336751-56337250)，两者均位于基因转录起始位点上游的2 kb区域。MALT1是一种信号蛋白，通过核因子κB通路在抗原受体介导的淋巴细胞活化中发挥关键作用，并在B淋巴细胞和T淋巴细胞的发育和功能、能量和胰岛素的代谢中发挥重要作用[31]。核因子κB 在T2DM相关慢性炎症中起重要作用，而MALT1的高甲基化和转录是否通过抑制核因子κB信号进而导致炎症，还有待进一步探索[32]。

Matsha等[33]采用DNA甲基化免疫沉淀测序法对南非少数民族混合血统妇女外周血中的DNA甲基化进行分析，包括3例T2DM患者、3例糖尿病前期患者和3例正常血糖者，其在T2DM患者与正常血糖者之间发现1 415个差异甲基化位点(均位于启动子区域)，其中超过80%的位点呈高甲基化，包括B细胞淋巴瘤3 、白细胞介素23亚单位α、F2R样胰蛋白酶受体1、S100钙结合蛋白A12、TNF受体超家族成员10b、 NIMA相关激酶6、环指蛋白31、溶质载体家族成员35B2、白细胞介素1受体相关激酶1结合蛋白1；根据染色体位置分组时发现，与正常血糖者和糖尿病前期患者相比，T2DM患者的3、6、11、13和17号染色体有更多的高甲基化区域，而1号染色体中有更多的低甲基化区域，其中这些高甲基化区域与T2DM相关通路相关，包括细胞表面信号通路、葡萄糖运输信号通路、胰岛素信号通路、胰腺发育等，而低甲基化区域则与炎性核因子κB级联、多不饱和ω-6脂肪酸、亚油酸及花生四烯酸等代谢途径有关。有趣的是，过量摄入多不饱和脂肪酸，会导致炎症增加，并导致包括肥胖和T2DM等慢性疾病的发生[34]。重要的是，Matsha等[33]还发现，正常血糖者与糖尿病前期患者之间的差异低甲基化区域与亚油酸和花生四烯酸代谢途径相关，这表明这些区域的甲基化改变可能发生在T2DM发病之前。

4 小 结

综上，基于EWAS技术筛选得到的TCF7L2、KCNQ1、ABCG1、TXNIP、PHOSPHO1、SREBF1、SLC30A8和FTO等基因，其相关位点的甲基化水平变化可能与T2DM有相关性，且其与T2DM发病风险的关联性独立于生活方式和环境因素之外，或可作为T2DM发病的潜在预测标志物。以上基因相关位点的甲基化水平在T2DM的发展过程中发挥着重要作用，包括能量摄入和支出(FTO基因)、脂肪生成和糖酵解(SREBF1基因)、葡萄糖稳态和碳水化合物代谢(TXNIP、TCF7L2基因)、脂质运输(ABCG1基因)、胰腺胰岛素分泌(SLC30A8、KCNQ1基因)和心血管相关并发症(PHOSPHO1基因)。但上述结论仍需要论证强度更高的大样本、前瞻性研究进一步验证，未来应开展二代测序研究和相关纵向队列研究以探寻与T2DM相关性更强的、更灵敏的风险预测标志物。