液相色谱-串联质谱分析在临床化学中的应用

李蕊（北京医药职工大学（中国北京同仁堂（集团）有限责任公司党校）,北京 100079）

液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC/MS/MS）是一种具有极高准确度和精密度的分析技术，但在临床实验室的常规使用中仍存在许多挑战和缺陷，如各种分析前因素的影响，以及由于基体效应而引起的离子抑制和与稳定同位素标记的内标相关的问题等。质谱分析是目前典型的实验室检测方法。随着液相色谱-串联质谱程序变得越来越自动化，越来越多与质谱分析相关的体外诊断商业化，液相色谱-串联质谱在实验室医学中的应用将显著增加。

1 介绍

每年都有越来越多的高灵敏度、用户体验良好的新型质谱仪被推出，质谱仪的更新升级是与时俱进的。质谱分析技术已成为基础生物学研究和临床医学的重要技术。随着质谱分析相关技术的快速发展，比如：样品制备方法、标记试剂、稳定同位素标记试剂和肽合成技术等，直接导致了“蛋白质组学”和“代谢组学”的快速发展。例如，最近有报道称，BoxCar采集方法可以在100分钟内对10,000个蛋白质进行单次蛋白质组学分析[1]。近年来，先进的仪器不仅用于基础研究，也用于专门的临床应用。在临床应用情况下，样品制备和液相色谱-串联质谱被集成到一个系统中。此外，先进的电离程序、操作系统、所需的试剂、校准器、质量控制样品和随时可用的溶剂，现在都可以拥有。现有的几种电离方法，如解吸电喷雾电离（Desorption Electro Spray Ionization，DESI）[2]、探针电喷雾电离（Probe Electro Spray Ionization，PESI）[3]和快速蒸发电离质谱（Rapid Evaporative Ionization Mass Spectrometry，REIMS）[4]已用于术中快速病理诊断和生物标本实时分析。随着技术创新的发展，质谱的临床应用将变得更加广泛。

质谱分析在各个领域都有应用，包括新生儿先天代谢错误筛查、法医毒理学和治疗药物监测等。质谱分析在实验室医学中最成功的应用是使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术快速鉴定微生物。事实上，临床诊断微生物学已经发生了革命性的转变[5]，该技术在全球范围内得到越来越多的应用。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对于血液培养标本中的细菌快速鉴定特别有用，与传统方法相比，其分析时间可缩短1.5-2天，从而有助于缩短住院时间并改善总体预后。

相比之下，基于液相色谱-串联质谱的常规临床化学检测方法应用仍较缓慢，因此应用只局限于大型医疗机构和参考实验室。许多挑战和限制阻碍了液相色谱-串联质谱的广泛使用。例如：与全自动免疫分析平台相比，液相色谱-串联质谱涉及复杂的操作流程，这方面就限制了其发展。

2 液相色谱-串联质谱在临床化学中的应用现状

目前，免疫分析在临床实验室被广泛用于检测蛋白质、多肽和激素。然而，免疫分析方法有一些局限性和缺点：如依赖于抗体特异性。在许多情况下，抗体的特异性不够，可能导致密切相关的化合物之间发生交叉反应。液相色谱-串联质谱就可以克服这一局限性，因此其在临床化学中得到越来越多的应用。质谱应用于临床实验的任务是加快质谱在临床实验室的实施，目的是帮助改善患者的护理标准，并降低医疗保健成本。

3 液相色谱-串联质谱在临床应用中的挑战和缺陷

液相色谱-串联质谱是一种高度精确的分析技术，在临床化学中越来越多地使用，但它在临床实验室的常规使用中仍然存在一些挑战和缺陷[6]，具体而言，各种分析前因素的影响、基质效应导致的离子抑制、稳定同位素标记内部标准的相关问题、自动化和标准化的缺乏等。

3.1 分析前因素的影响 体外诊断仪器的质素保证以多种方式进行。胆红素、血红蛋白和乳糜的干扰也要用液相色谱-串联质谱检查。当抗体的使用包括在样品制备的第一步，如1α，25-二羟基维生素D的测量[7]，类风湿因子对分析物的特定抗体的影响必须排除。抗体常用于靶向蛋白质组学，以量化低丰度多肽。

目前临床化学实验室使用的采血管主要用于比色分析和免疫分析，不适合用于液相色谱-串联质谱。因此，当使用这些试管进行基于质谱的分析时，可能获得的结果并不准确。

其次，静脉穿刺和血清分离之间的时间间隔对血清肽谱有显著影响。在血清生物标志物的探索中，考虑储存温度和储存周期的影响是非常重要的。从事临床质谱分析的人员必须考虑到从样品采集到分析的一系列操作对检测结果有很大的影响。

3.2 样品制备对降低基质效应的作用 在组分极其复杂的生物样品中，为了准确测量目标分析物，需要适当的样品制备。“基质效应”是指共洗脱物质的存在对离子源区域内分析物的聚簇和电离过程产生的整体影响[8]。一般来说，适当的样品制备和色谱分离可以缓解基质效应。此外，由于粗样品直接注入设备，样品制备不足不仅缩短了液相色谱柱的寿命，还增加了设备停机的风险。基质效应可以通过柱后用t片将目标分析液从高效液相色谱柱注入淋洗液来确认[9]。磷脂是影响基质效应最显著的因素之一，其洗脱模式可以通过前驱体离子扫描在质谱图中184m/z处峰位来进行确定。通过对四种样品制备方法：蛋白沉淀法（PP）、液-液萃取法（LLE）、固相萃取法（SPE）和支撑液萃取法（SLE）的比较，液相色谱分离使用了反相分配系统的色谱柱，该系统根据脂溶性分离分析物。在指定的洗脱时间，使用蛋白沉淀法和固相萃取法检测到较强的离子抑制，而液-液萃取法的离子抑制最小。

固相萃取并不能有效地去除基质效应，这很可能是因为固相萃取柱和液相色谱柱采用了相同的反相分离模式。为了有效的前处理，固相萃取必须采用不同于液相色谱柱的分离模式，如离子交换和混合模式。固相萃取中，磷脂柱里通过填充氧化锆二氧化硅涂层来有效地去除磷脂的影响[10]。液-液萃取的离子抑制最弱，因为它的分离是基于极性，而不是相反的相位分布模式。由于固液萃取与液-液萃取的分离模式相同，有效地消除了基质效应。然而，液-液萃取不适合大规模研究，因为这种技术不是自动化的。另一方面，固相萃取，固液萃取可以很容易地自动化。自动化样品制备使取样程序一致。最终，包括数据分析和接口的完全自动化将是进一步加快液相色谱-串联质谱临床应用的关键。

基质效应的程度因电离模式的不同而有不同程度的影响。离子抑制在电喷雾电离正极模式下表现较好，而在电喷雾电离、大气压化学电离和大气压光电离下表现较差。最近有报道称，一种新的商用大气压电离源UniSprayTM（Waters，USA）与电喷雾电离相比，根据目标分析物的不同，略微降低了基质效应[11]。

3.3 稳定同位素标记内标物 内标物是十分必要的，可以补偿基质效应和纠正样品制备步骤中潜在的变化。一般将2H、13C、15N和18O标记的化合物用作内标物，虽然2H标记内标物的洗脱时间比反相分离的目标分析物略快，但仍需要仔细注意磷脂和其他化合物引起的基质效应。另一方面，13C、15N和18O标记的内标物可能比2H标记的内标物更有用，因为它们的洗脱时间几乎接近目标分析物。值得注意的是，1H-2H交换是否会发生，取决于标记的位置的不同，导致的内标物响应也不同[12]。因此，稳定同位素标记的内标物在临床质谱分析中是不可或缺的，但2H标记的内标物在大多数潜在的分析物中并不广泛可用。

3.4 校准器和血清认证标准物质 校准器作为原始数据转换为目标分析物浓度的参考，使用有缺陷的校准器会导致错误的结果。《纽约时报》2009年1月7日的一篇文章震惊了LC/MS/MS协会：Quest（美国著名的私人医学实验室之一）的一位发言人承认，由于校准器的问题，一些错误的1α，25-二羟基维生素D结果已经被报道出来。尽管人们普遍认为，液相色谱-串联质谱测量的实验室间差异与免疫分析相比要小很多，但根据FDA在2016年5月举行的研讨会上由美国病理学家学院（CAP）提出的关于1α，25-二羟基维生素D的调查结果显示，情况并不是这样的。如果使用通用校准器，实验室间的差异可能会得到改善[13]。考虑到他们提交给国际质量评估计划的结果显示实验室间的一致性较差，卡特和琼斯试图说明使用一个共同的标准是否可以减少这种不一致性[14]。

虽然校准器的基质与真实样品的基质相同是可取的，但当目标分析物是内源性化合物时，这种方法就不太可取。在没有真正空白的情况下，用液相色谱-串联质谱成功定量生物样品中的内源分析物是十分具有挑战性的。一种方法是对血清样品进行预处理，尽可能多地去除特定的内源性分析物；另一种方法是使用2H标记化合物作为生成校准曲线的替代分析物。

牛血清白蛋白（BSA）溶液（4%-7%）常被用作基质替代品，但BSA溶液中可能含有与目标分析物的结合蛋白，应予以注意。1α，25-二羟基维生素D值偏差较大可能是牛血清白蛋白中维生素D结合蛋白污染物造成的[14]。市售重组人血清白蛋白（HSA）不含可检测到的1α，25-二羟基维生素D，可以用作基质。因此在检测中重要的是，不仅要注意用于校准器的基质类型，而且要注意标准材料本身的纯度。

3.5 数据分析和仪表控制软件 目前最新的液相色谱-串联质谱平台，可以定义峰检测方法，设置允许自动峰检测。现有的质谱仪器采用了几种不同的峰检测算法，但对于其有效性，需要检查自动得到的结果与液相色谱-串联质谱专家手动得到的结果是否一致。为了使液相色谱-串联质谱平台更适用于常规临床实验室分析需要全面的自动化，包括自动样品制备、复杂的数据审查软件，以及与实验室信息系统的数据平台接口。质谱分析平台制造商使用了易于操作的分析物进行他们的标准性能测试，以确保仪器的功能。

4 总结

目前，质谱分析大多是实验室开发的，劳动密集，并需要相当多的具有专业知识的工作人员来进行方法开发和验证。随着液相色谱-串联质谱程序变得越来越自动化，越来越多与质谱相关的体外诊断商业化，液相色谱-串联质谱在实验室医学中的应用将显著加快。