电纺漆酶催化降解水中双酚A性能研究

赵 鑫，马桂敏，尹 娟，王正川，李赫龙，徐 强

(1. 深圳市广汇源环境水务有限公司，广东 深圳 518011；2. 广东省城市水环境与水务信息化工程技术研究中心，广东 深圳 518011)

0 引 言

双酚A(Bisphenol A，BPA)，即2,2-双(4-羟基苯基)丙烷，是一种具有内分泌干扰性的类雌性激素，属于难挥发、疏水性有机污染物[1]。BPA被广泛应用于制造聚碳酸酯、环氧树脂等高分子材料，也可用于生产粘合剂、抗老化剂、粉末涂料等工业制品。由于应用广泛，BPA可通过多种途径进入水体，污染地表水和地下水。BPA对脊椎动物具有激动雌激素受体的作用，可诱导脊椎产生前凸反应，引起假早熟[2]；对于两栖类动物，可引发性逆转；对于哺乳动物，则会导致子代变异效应，如子代的畸形、死胎、体重下降、肝多核细胞增加及纤维性骨萎缩等现象。BPA进入人体内后会干扰体内正常激素的分泌，从而影响生殖功能，导致恶性肿瘤的产生[3-4]。

漆酶可以用于降解水中BPA。漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是含有4个铜离子的多酚氧化酶，能催化多种芳香族化合物，如各种酚类染料、氯酚、硫酚、多氯联酚、BPA、芳香胺、杀虫剂等的降解，可与之作用的底物相当广泛[5]。与直接利用微生物的水处理技术相比，酶催化反应本身具有分解效率高、毒性小、操作简便、使用范围宽的优点。然而，由于漆酶本身易溶于水、不可重复使用、容易变性失活、价格偏高，使它在实际中的应用受到了限制，而通过酶的固定化技术，则可以实现酶的重复连续使用。漆酶的固定化是指将水溶性漆酶以物理或化学的方法固定在有机或无机的载体上，形成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物，使其仍具有催化活性，并可回收及重复使用的方法与技术[6-7]。与游离酶相比，固定化漆酶易从反应体系中分离出来，可以重复使用，提高酶的化学稳定性，能够严格控制酶反应过程，同时易从使用环境中分离，提高了酶的使用效率，降低其使用成本[8]。

本研究采用静电纺丝纤维膜作为漆酶固定化的载体，利用包埋法固定化漆酶。借助静电纺丝包埋漆酶，形成核-壳结构载酶纳米纤维，先在聚合物溶液中加入一定量的表面活性剂，再加入酶溶液混合形成均匀的乳液，然后将乳液引入静电纺丝装置中进行电纺，从而得到载酶纤维膜[9]。本研究重点考察了载酶纤维膜的催化活性和稳定性，评价了其在降解模拟地表水中BPA的过程中的实际应用价值。

1 实验方法

1.1 纺丝液和游离漆酶溶液的制备

称取1.8 g聚乳酸-乙醇酸共聚物(PDLGA)，0.2 g 嵌段聚醚F108和20 g二氯甲烷，经磁力搅拌器震荡2 h，至充分溶解即制成纺丝液。其中，加入与聚合物PDLGA质量比为10%的F108作为乳化剂。使用超纯水制备漆酶(真菌漆酶，CAS 80498-15-3，西宝生物科技，在30 ℃、pH 6.5、3 mL反应体积中，以丁香醛连氮为底物时，1个单位每分钟将产生的Δa530为0.001)溶液，将漆酶与超纯水按照一定比例混合，经过震荡使之充分溶解，分别制成5 mg/L和15 mg/L的漆酶水溶液。漆酶溶液现配现用，以防止酶失活。5 mg/L漆酶溶液用于做游离漆酶降解实验，15 mg/L漆酶溶液则用于制备载酶电纺纤维膜。

1.2 漆酶的固定化和电纺纤维膜制备

按照上述步骤制备纺丝液后，在纺丝液中加入0.5 mL、15 mg/L的漆酶溶液充分震荡混合形成均匀溶液，即制成载漆酶纺丝液。将0.5 mL漆酶溶液替换为0.5 mL超纯水按同样方法震荡混合制成空白膜纺丝液。载漆酶纺丝液现配现用。

乳液电纺的步骤如图1所示，使用的装置是自制的静电纺丝装置，由直流高压电源、喷丝头和接收装置组成。静电纺丝采用20 kV高压电场，纺丝液喷射针尖及收集器之间的距离为15 cm。使用塑料滴管手动将纺丝液引入纺丝容器中，调节各参数获得稳定连续的喷射，喷射出的纤维用铝箔纸进行收集。在纺织载酶膜时注意避光。待纤维膜厚度达到0.5～1.0 mm时，停止纺丝。一般情况下，纺一张足够厚的膜需要40 min。纺织完成的膜放置在干燥避光处待其晾干。空白膜可储存在4 ℃的条件下以备下次试验使用，载酶膜须现纺现用，防止酶失活。

图1 乳液电纺流程图Fig.1 Flow chart of emulsion electrospinning

1.3 电纺纤维膜形态结构的表征

固定化漆酶电纺纤维膜的形态特征采用场发射扫描电子显微镜(FESEM S-4800，Hitachi)来观察表征。在静电纺丝过程中，电纺纤维用激光共聚焦扫描显微镜(LCSM LSM510,ZEISS)观察。固定化漆酶电纺纤维膜的比表面积和孔体积的测定采用是比表面孔分布测定仪(ASAP2020,Micromerities)。为了验证漆酶是否已经被包埋入电纺纤维之中，使用配制好的纺丝液加入等量的未作标记的漆酶溶液和用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的漆酶溶液分别进行静电纺丝，静电纺丝之后均在激光共聚焦扫描显微镜(LCSM)下观察其包埋情况[10]。

1.4 游离漆酶及电纺纤维膜固定化漆酶酶活性的测定

通过紫外可见分光光度计测定漆酶催化氧化2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)过程中的吸光度变化来确定漆酶活性，测量波长为420 nm[11]。游离漆酶和电纺纤维膜固定化漆酶的酶活稳定性和持久性通过30 d的连续测定得到，在此期间，游离漆酶及固定化漆酶样品均在4 ℃下，储存在pH为3.5的磷酸盐缓冲溶液中。为了减小实验误差，每次实验之前电纺纤维膜均经磷酸盐缓冲液淋洗3次，再与ABTS溶液反应。每个反应重复10次。

1.5 游离漆酶和固定化漆酶对水中双酚A的降解实验

分别量取0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 mL 的1 000 mg/L BPA标准液于100 mL容量瓶中，定容，配制成为100 μg/L、500 μg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的BPA水溶液。称取一定量漆酶固体与超纯水混合，震荡至完全溶解，形成5 mg/mL的漆酶溶液。每个反应瓶中加入30 mL不同浓度的BPA水溶液和20 μL、5 mg/L的漆酶溶液，每个浓度各设置3组平行样。将反应器放入恒温振荡箱中进行反应，振荡箱温度设置为25 ℃，转速设为160 r/min。取样时间为5 min、10 min、20 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h。从每个反应器中吸取等体积的反应液置于液相色谱进样瓶中，每个样品取完后立即加入20 μL、0.1 mol/L的NaN3溶液，以抑制酶活性。

按上述步骤，将游离漆酶降解BPA实验中加入的20 μL、5 mg/L漆酶溶液替换为3片经裁剪称量完毕的载酶膜即为固定化漆酶降解BPA实验。

1.6 不同温度下游离酶和固定化漆酶对双酚A的降解实验

采用浓度为5 mg/L的BPA溶液进行实验，首先量取一定量1 000 mg/L的BPA标准液与超纯水混合，配制5 mg/L的BPA水溶液。每个反应器中加入30 mL配制完毕的BPA水溶液，并加入20 μL、5 mg/L的漆酶溶液。将反应器放置于恒温振荡箱中分批次进行反应，箱内温度分别设为5、15、35、45 ℃，转速均设为160 r/min，取样时间及样品保存方法同上。进一步地，按上述步骤，将游离漆酶溶液替换为3片经裁剪称量完毕的载酶膜即为不同温度下固定化漆酶对BPA的降解实验。

1.7 水中双酚A的浓度检测

采用高效液相色谱(HPLC，Waters 1525)测定BPA浓度，检测器为UV(Dual λ Absorbance Detector，Waters 2487)，C18反向液相色谱柱为，流动相体积比为乙酸水溶液∶无水甲醇=2∶8，检测波长为280 nm，流速为1 mL/min，进样量为10 μL。

2 结果与讨论

2.1 电纺纤维膜形貌的表征

运用静电纺丝技术能够使水-油型(W/O型)或油-水型(O/W型)乳液形成核-壳结构纤维[12]，作为水相的漆酶可以直接包埋进入电纺纤维的核心，并且核-壳结构纤维能够有效保护包埋入的蛋白质，使其保持结构完整性和生物活性[13]。

图2 电纺纤维的SEM图Fig.2 SEM diagrams of electrospun fibers

图2为放大100、2 000、10 000、22 000倍后，在场发射扫描电子显微镜(SEM)下电纺纤维的照片。从图中可以看出，电纺纳米纤维膜形态类似无纺布，纤维成无序状态排列。增大放大倍数之后，可以清晰地看到，每一根电纺纳米纤维表面均疏松多孔，孔隙率高，与一般的超细纤维相比，具有更大的比表面积，有利于反应底物的附着和反应的进行。

图3为用经FITC标记的载酶纺丝液静电纺丝后得到的电纺纳米纤维膜在激光共聚焦扫描显微镜(LCSM)下的照片。图中电纺纤维内部有带红色荧光的部分，即为带FITC标记的漆酶。如图3可知，漆酶溶液已经成功包埋于电纺纳米纤维之中，形成壳-核结构。

图3 经FITC标记的载酶电纺纳米纤维膜激光共聚焦扫描显微镜照片Fig.3 Confocal scanning microscopy images of FITC-labeledenzyme-loaded electrospun nanofiber membranes

相比一般方法制备的纤维膜，通过静电纺丝获得的超细纤维膜具有极大的比表面积和多孔结构，有利于提高反应底物对漆酶的结合位点的传输速率，以及其优越的机械性能，使得超细纤维膜易从反应液中恢复，可二次使用。同时，静电纺丝制备纤维膜操作简单，制备成本低，制备的电纺纤维膜持久耐用，易于分离回收。因此，静电乳液电纺纤维膜可以认为是以包埋法固定化漆酶的理想载体。

2.2 漆酶活性评价

经紫外可见分光光度计测定漆酶催化氧化ATBS过程中的吸光度的变化，电纺纳米纤维膜固定化漆酶对游离酶的活性保留率为78.5%。从这个结果可以看出，电纺纤维具有良好生物相容性的聚合物外壳，既保持了酶的活性，又保护了内部的漆酶分子不受外界环境变化的影响。纤维表面的多孔结构便于反应基团与漆酶分子的结合与分离，增加了漆酶的活性。电纺纳米纤维膜这种特殊的结构提高了纤维内部漆酶活性的稳定性。

以PDLGA材料制备电纺纤维膜，且在相同条件下对100 μg/L和500 μg/L的BPA溶液进行反应，考察吸附性。结果表明，PDLGA制备的电纺纤维膜对水中BPA无明显吸附。经5 h的反应之后，各组对两种浓度的BPA溶液的吸附率均在20%以内，故本研究不考虑膜本身对BPA的吸附，只考察游离酶及固定化酶对BPA的降解作用。20 μL、5 mg/L的漆酶溶液与30 mL不同浓度的BPA水溶液反应2 h，降解率随时间变化如图4(a)所示。通过静电纺丝制备电纺纤维膜，并载入漆酶。每一张约45 cm × 45 cm、厚0.5～1.0 mm的膜载有0.5 mL、15 mg/L的漆酶溶液。将膜剪成1.5 cm ×1.5 cm小方块之后，每30 mL BPA溶液加入3片小方块膜反应2 h，其降解率随时间变化如图4(b)所示。

图4 游离漆酶及固定化漆酶降解水中不同浓度BPA的降解效率-时间曲线Fig.4 Degradation efficiency-time curves for the degradation of different concentrations of BPA in waterby free enzyme and immobilized enzyme

此游离酶和载酶膜对BPA的降解实验旨在比较游离酶和固定化酶对水中BPA降解率的高低及随时间的变化。从图中可以看出，总体上来说，在2 h的反应时间内，对各浓度的BPA溶液，游离酶的降解率要高于固定化酶。游离酶对100 μg/L的BPA溶液在2 h内可以全部降解，而固定化酶对其的降解率可达83.5%。由于固定化的过程中对酶活不可避免地会产生一定的损失，且酶固定化后，与反应物的接触面积比游离酶小，故固定化酶在相同时间内对BPA的降解率低于游离酶。从时间上来看，游离酶及固定化酶对各浓度BPA的降解率均随时间递增。相同酶量的游离酶和固定化酶对不同浓度的BPA溶液的降解率随BPA的浓度增加而降低。对于高浓度(100 mg/L)的BPA溶液，游离酶及固定化酶的降解率分别为32.4%和31.7%。

2.3 温度和pH对漆酶活性的影响

一般来说，生物酶产品受环境温度和pH的影响较大，因此本研究重点考察温度和pH对酶活的影响以及酶固定化前后活性和稳定性的变化。本研究比较了5个温度梯度下相同酶量对5 mg/L BPA溶液的降解作用(如图5所示)。从图5可以看出，漆酶对高温的耐受性较好，对低温的耐受性较差。5 ℃条件下，2 h内游离酶对BPA的降解率为29.8%，固定化酶在此温度下的降解率为31.2%，游离酶降解率不如固定化酶。在45 ℃条件下，游离酶的降解率可达89.4%，固定化酶为71.2%，游离酶随温度升高降解率波动比固定化酶剧烈。总体上来说，固定化酶对BPA的降解率随温度变化在31.2%～71.2%范围内波动，而游离酶则在29.8%～89.4%范围内波动，故漆酶固定化后受温度影响比游离漆酶要小，即固定化酶对温度变化的耐受能力强于游离酶。

H3PO4和NaOH溶液调节30 mL、5 mg/L BPA溶液的反应体系溶液pH为1、3、5、7、9后，加入20 μL、5 mg/mL的游离漆酶溶液或3片1.5 cm×1.5 cm的载酶膜小方块反应2 h，BPA降解率随时间变化如图6所示。

图5 不同温度下游离漆酶和固定化漆酶对BPA降解率随时间变化Fig.5 The degradation efficiency of BPA over time by free laccase and immobilized laccase at different temperatures

图6 不同pH下游离漆酶和固定化漆酶对BPA降解率随时间变化Fig.6 The degradation efficiency of BPA over time by free laccase and immobilized laccase at different pH values

与温度类似，漆酶的活性受pH影响也较大。不同来源的漆酶，最适pH也不同。本实验同样对比了5个pH梯度下游离酶和固定化酶对5 mg/L BPA溶液的降解率和随时间变化规律。从图中可以看出，游离酶降解率最高的pH为7，此时对应的2 h降解率为59.8%，而固定化酶最佳pH为5，此时对应的降解率为64.7%。此外，固定化酶对pH变化的耐受性要远远强于游离酶。当pH为1时，游离酶的降解率为0，而固定化酶在pH=1时仍有12.2%的降解率。在pH=9时，游离酶与固定化酶的降解率均为37.2%。总体上来说，固定化酶对BPA的降解率随pH变化在12.2%～64.7% 范围内波动，而游离酶则在0～59.8%范围内波动。总体上来说，固定化酶的稳定性优于游离酶，在特定条件下的催化活性也有一定优势。

3 结 论

(1)漆酶以壳-核结构成功包埋于电纺纳米纤维之中，该固定化漆酶对游离酶的活性保留率为78.5%。

(2)2 h内，固定化酶对100 μg/L的BPA溶液的降解率为83.5%，对100 mg/L的BPA降解率为31.7%。

(3)固定化酶对BPA的降解率随温度变化在31.2%～71.2%范围内波动，游离酶随温度变化在29.8%～89.4%范围内波动。

(4)固定化酶对BPA的降解率随pH变化在12.2%～64.7%范围内波动，游离酶随pH变化在0～59.8%范围内波动，故固定化酶的活性稳定性优于游离酶。