亚甲基蓝类似物抗谷氨酸诱导HT22细胞氧化损伤及其机制

陈紫微，陈秋荷，蔡瑜，侯姗姗，刘福和

1.浙江药科职业大学 药学院，浙江 宁波 315000；2.广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006

氧化应激（oxidative stress, OS）是指机体内产生的活性氧（reactive oxygen species, ROS）与机体抗氧化防御功能失衡。机体内过多的ROS通过氧化损伤多种重要的生物分子如脂质、DNA和蛋白质，进一步损害中枢神经系统功能[1]。目前研究认为多数老年相关的慢性疾病，如阿尔茨海默病 （Alzheimer’s disease, AD）、帕金森病（Parkinson’s disease, PD）、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、糖尿病、心血管病等都与机体内氧化应激损伤直接相关[2-3]。

亚甲基蓝（methylene blue, MB）具有广泛的生物活性、良好的药代动力学性质及较低的毒性，被广泛应用于医学领域。目前，MB主要用于高铁血红蛋白血症、疟疾、环磷酰胺神经毒性等疾病的治 疗[4]。MB类似物是一类与MB具有相似化学结构的化合物，基于广泛的研究发现：MB类似物与MB相似，具有广泛的生物活性，包括抗菌作用、抑制单胺氧化酶活性产生抗抑郁作用、抗氧化损伤作用等[4-8]。然而，目前关于MB结构类似物的抗氧化损伤及其机制研究鲜有报道，深入研究MB类似物的作用及其机制，并对其进行结构相关性分析，对该类相关药物的研发、应用具有重要意义。本研究筛选出4种与MB结构类似的化合物：2-氯吩噻嗪（2-chlorophenothiazine,2-C）、天青A（azure A, A-A）、天青B（azure B, A-B）、中性红（neutral red, NR），见图1。通过毒性分析、抗氧化活性分析及机制研究，阐明以上4种化合物抗谷氨酸（glutamate, Glu）诱导的HT22细胞毒性作用及机制，并进一步分析化合物结构与活性的关系。

图1 MB、NR、A-B、A-A及2-C的化学结构

肌细胞增强因子2（myocyte enhancer factor 2, MEF2）在机体生理和病理过程中发挥着重要作用。有研究表明，它们还与哺乳动物中枢神经系统的神经元存活、发育、分化和神经元可塑性密切相关[9]。 MEF2D是MEF2转录因子蛋白家族的成员，在调节神经系统的发育和功能方面发挥着关键作用[10]。SALMA等[11]研究发现抑制MEF2D活性可引起胚胎海马神经元的凋亡。此外，研究发现OS可通过破坏MEF2D功能，参与多种神经退行性疾病的发生发 展[12-13]，如GAO等[14]研究表明：OS可通过氧化MEF2D使其失活，进一步诱导DA神经元死亡。因此，研究认为MEF2D可能成为抗OS损伤的重要作用靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：本研究所使用的细胞株为HT22细胞，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.1.2 试剂：MB、2-C、A-B、A-A、NR购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胎牛血清，DMEM干粉由购自美国Gibco公司；H2DCF-DA、DMSO、Glu、MTT、胰蛋白酶购自美国Sigma公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）检测试剂盒购买于南京建成生物科技有限公司。T-糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase, GSK3β）、pSer9-GSK3β、pSer473-Akt、NADH脱氢酶6（NADH dehydrogenase, ND6）、TAkt一抗购自美国Santa Cruz公司（稀释：1:500），MEF2D一抗购自美国BD Biosciences公司（稀释：1:5 000），β-actin一抗购自美国Sigma-Aldrich公司（稀释：1:10 000）；山羊抗兔二抗购自美国Santa Cruz公司（稀释：1:1 000），兔抗鼠二抗购自美国Promega公司（稀释：1:10 000）。其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.1.3 仪器：恒温震荡箱（SHELLAB，美国），滤器（0.22 μm，Millipore，德国），多功能酶标仪工作站（Floxo，美国），细胞培养箱（Themo-fisher，美国），生物净化工作台（苏州净化设备有限公司），倒置显微镜（重庆光学仪器厂），台式低温高速离心机（Eppendorf，德国），-80 ℃超低温冰箱（Sanyo，日本），光学显微镜（Olympus，日本），酶标仪（BioTek，美国），垂直板蛋白电泳仪、电转移（BioRad，美国），发光分子生物成影仪（Image Quant LAS 4000 mini，美国）。

1.2 方法

1.2.1 HT22细胞培养：从液氮罐中取出HT22细胞，迅速放置于37 ℃水浴锅内复苏，将细胞液转移至15 mL离心管中，并加入3 mL 10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，混匀，随后将离心管放入离心机 1 000 r/min离心5 min，离心后用移液枪小心吸去上层培养基，加入3 mL新鲜培养基，混匀，转移至中皿，放置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养。当细胞密度达到90%时传代。

1.2.2 建立细胞模型：HT22细胞是一种永生化的小鼠海马神经元细胞系，其细胞缺少Glu受体[15]，因此该细胞暴露在高浓度Glu下能够产生明显的OS损伤。该模型是研究OS的一种经典模型。通过前期实验研究和相关文献检索，采用2 mmol/L的Glu处理HT22细胞24 h，造成氧化损伤细胞模型。

1.2.3 MTT法检测化合物对HT22细胞毒性：当HT22细胞处于对数生长期时进行实验，使用胰酶将细胞消化，离心，弃去旧培养基，加入适量新培养基，调整细胞密度，吸取100 μL细胞液于96孔板中使细胞密度达到1×104/孔。培养24 h弃去旧培养基加入各浓度化合物100 μL，使各化合物浓度分别为 1 μmol/L、3 μmol/L、10 μmol/L，以加DMSO为对照组（CT组）。24 h后，加入10 μL MTT试剂，置于孵箱中孵育2 h；吸去上清液，每孔加入DMSO 100 μL， 置于孵箱，孵育15 min。在多功能酶标仪测定各个孔在570 nm处的吸光度。细胞存活率计算公式： （OD样品-OD空白）/（OD对照-OD空白）×100%。化合物半数致死量（median lethal dose, LD50）检测时各个化合物浓度分别为0.3 μmol/L、1 μmol/L、 3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L、100 μmol/L、300 μmol/L、1 mmol/L；以含相同浓度DMSO为对照组，其余操作与MTT检测相同。

1.2.4 MTT法检测化合物对Glu诱导HT22细胞损伤的保护作用：当HT22细胞处于对数生长期时进行实验，使用胰酶将细胞消化、离心，弃去旧培养基，加入适量新培养基，调整细胞密度，吸取100 μL细胞液于96孔板中使细胞密度达到1×104/孔。培养24 h 弃去旧培养基加入各浓度MB及其类似物100 μL，使各化合物浓度分别为30 nmol/L、100 nmol/L、 300 nmol/L，上述药物孵育30 min后，均加入终浓度为2 mmol/L的Glu。同时设置DMSO对照组（CT组）及Glu组，每组6个复孔，孵育12 h后，每孔加入10 μL 的MTT储备液，于37 ℃避光孵育2 h；吸去上清液，加入DMSO 100 μL，置于孵箱中15 min，在多功能酶标仪测定各个孔在570 nm处的吸光度。细胞存活率计算公式： （OD样品-OD空白）/（OD对照-OD空白）×100%。半数有效量（50% effective dose,ED50）检测时各个化合物浓度分别为10 nmol/L、 20 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、300 nmol/L；以含相同浓度DMSO为对照组，其余操作与MTT检测相同。

1.2.5 LDH法检测化合物对Glu诱导HT22细胞损伤的保护作用：当HT22细胞处于对数生长期时进行实验，使用胰酶将细胞消化，离心，弃去旧培养基，加入适量新培养基，调整细胞密度，吸取100 μL细胞液于96孔板中使细胞密度达到1×104/孔。24 h后弃旧液，加入各浓度MB及其类似物100 μL，使各化合物浓度为100 nmol/L。细胞分为对照（CT）组、Glu组、药物处理组，测定时以上分组分别测定样品对照OD值（不加辅酶I）和样品测定OD值（加辅酶I），各组LDH释放百分率计算公式为： （样品测定OD值-样品对照OD值）/（正常组测定OD值-正常组对照OD值）×100，实验重复3次。

1.2.6 H2DCF-DA染色法检测细胞内ROS：H2DCF-DA染色用于检测细胞内ROS含量的常用方法。当HT22细胞处于对数生长期时进行实验，使用胰酶将细胞消化，离心，弃去旧培养基，加入适量新培养基，调整细胞密度，吸取500 μL细胞液于24孔板中使细胞密度达到1×104/孔。24 h后弃上清液，加入各浓度MB及其类似物500 μL，使各化合物浓度为 100 nmol/L，化合物预处理30 min后，均加入终浓度为2 mmol/L的Glu，孵育12 h，同时设置DMSO对照组（CT组）和Glu组。细胞处理结束后吸走培养基，用预温PBS轻轻洗细胞2次，吸干PBS，每孔加入500 μL含10 μmol/L H2DCF-DA的无血清DMEM培养基，37 ℃孵育30 min，吸走培养基，用预温PBS轻轻洗细胞两次，以0.25%胰酶消化收集细胞，1 000×g离心5 min，弃上清液，每管加入200 μL无血清DMEM培养基重悬细胞，加入到96孔黑板中，荧光分光光度计测量荧光强度，H2DCF-DA的激发光波长为490 nm，发射光波长为525 nm。

1.2.7 Western blot检测蛋白水平：细胞处理后，弃去培养基，PBS轻洗细胞2次，使用三去污裂解细胞，置于冰上裂解30 min，离心取上清液；使用BCA法检测各组细胞总蛋白量。调整各组细胞浓度到同一浓度。在沸水中煮7 min使蛋白变性。使用8%～10%的SDS-PAGE电泳，电转（60 min，300 mA）。使用脱脂牛奶封闭液孵育PVDF膜，在摇床上使用TBST溶液洗PVDF膜，共3次，每次5 min。在4 ℃冰箱中孵育一抗12 h；在常温下孵育二抗1～2 h，在摇床上使用TBST溶液洗PVDF膜，共3次，每次5 min。显影时在每张膜上滴加发光液，显影成像。

1.2.8 siRNA干扰：细胞接种于35 mm培养板，待细胞密度为40%～60%开始转染。配制转染溶液：A：10 μL siRNA+250 μL Opti-MEM，混匀；B：5 μL lipofectamine 3000+250 μL Opti-MEM，混匀，室温静置5 min；配制A液和B液期间将细胞用PBS洗2次，加入1.5 mL Opti-MEM；20 min后，在细胞培养皿中加入500 μL的A、B混合液，混合混匀；将细胞放回37 ℃培养箱中继续培养4～6 h后将转染液换成完全培养基继续培养，用于Western blot实验和MTT实验。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS软件进行数据统计处理。数据用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t法。根据数据结果使用Graphpad prism 7.0制作柱状图，使用Adobe Photoshop作Western blot条带图。所有实验均重复3次。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MB及类似物对HT22细胞活力的影响 与CT组相比，Glu组细胞存活率明显降低（P＜0.01）。1～10 μmol/L的2-C、A-A、A-B分别处理HT22细胞24 h，均未见明显毒性（P＞0.05）。10 μmol/L NR与MB能够明显降低细胞活力（P＜0.01）。2-C在10 μmol/L 浓度下能够提高细胞活力（P＜0.01）。见图2。LD50计算结果显示，MB：LD50=（50.66±5.87）μmol/L， 2-C：LD50=（175.90±16.53）μmol/L，A-A：LD50=（152.40±18.36）μmol/L，A-B：LD50=（140.40± 12.48）μmol/L，NR：LD50=（73.19±8.49）μmol/L，结果表明化合物2-C、A-A、A-B及NR对HT22细胞的细胞毒性均低于MB。

图2 MB及类似物对HT22细胞活力的影响

2.2 MB类似物抗Glu诱导的HT22细胞损伤作用 NR 在30～300 nmol/L浓度范围对Glu诱导的HT22细胞损伤没有明显保护作用（P＞0.05）；30 nmol/L浓度的2-C、MB、A-B能够明显提高HT22细胞存活率（P＜0.01），其保护作用呈剂量依赖性。A-A在30 nmol/L 浓度下未显示明显保护作用，但在100 nmol/L和300 nmol/L浓度时均能明显提高细胞存活率（P＜ 0.01），见图3。EC50计算结果显示，2-C[EC50=（34.32± 4.93）nmol/L]抗Glu诱导细胞损伤活性高于MB [EC50=（42.13±5.21）nmol/L]。A-A EC50=（48.96± 4.64）nmol/L，A-B EC50=（44.42±2.76）nmol/L。 LDH实验结果与MTT结果一致：2-C、A-B、A-A在 100 nmol/L浓度下均能显著降低Glu诱导的LDH释放（P＜0.01），而NR对Glu诱导的LDH释放无明显作用，见图4。

图3 MB类似物对Glu诱导的HT22细胞的保护作用

图4 MB类似物对Glu诱导的HT22细胞中LDH释放的影响

2.3 MB类似物减少Glu诱导的HT22细胞内ROS Glu组细胞内ROS含量明显升高，在100 nmol/L浓度下，NR处理组对Glu诱导产生的ROS没有明显改善；2-C，A-B、A-A均能够明显降低Glu诱导的ROS水平。见图5。

图5 MB及类似物减少HT22细胞中Glu诱导产生的ROS水平

2.4 MB类似物对MEF2D蛋白表达的影响 采用Western blot法检测化合物对HT22细胞内MEF2D 蛋白水平的影响，结果见图6，Glu可显著降低HT22细胞内MEF2D蛋白水平（P＜0.05），而化合物2-C、A-B、A-A和MB在100 nmol/L浓度下即能够明显升高HT22细胞内MEF2D水平（P＜0.05或P＜0.01），NR对HT22细胞中MEF2D蛋白水平没有明显影响（P＞0.05）。

图6 MB类似物提高HT22细胞中的MEF2D蛋白水平

2.5 干扰MEF2D对MB类似物抗Glu诱导HT22细胞损伤作用的影响 采用siRNA干扰序列，抑制细胞中MEF2D表达，进一步检测MB类似物抗Glu诱导HT22细胞损伤作用，结果显示干扰MEF2D后，化合物2-C、A-B、A-A对HT22细胞的保护作用明显降低（P＜ 0.01），这一结果提示MEF2D至少部分参与了化合物2-C、A-B、A-A抗Glu诱导的HT22细胞损伤作用。见图7。

图7 siRNA干扰MEF2D后对MB类似物抗Glu诱导HT22细胞损伤作用的影响

2.6 MB类似物激活Akt/GSK-3β/MED2D通路 采用Western blot法检测MB类似物对T-Akt、p-Akt、T-GSK-3β、p-GSK-3β蛋白水平的影响。100 nmol/L 2-C、A-B、A-A处理细胞24 h后，细胞内p-Akt/T-Akt比值显著提高，p-GSK-3β/T-GSK-3β比值同样明显升高（P＜0.05）。见图8。

图8 MB类似物激活Akt/GSK-3β通路

2.7 Glu细胞模型中MB类似物激活Akt/GSK-3β/MED2D/ND6通路 在Glu诱导的HT22细胞氧化损伤模型中发现2-C、A-B、A-A能够激活Akt，增加GSK-3β磷酸化来抑制GSK-3β活性，提高MEF2D蛋白水平，同时能够提高线粒体编码蛋白ND6的蛋白水平（P＜0.05），见图9。这一结果进一步证明Akt/GSK-3β/MEF2D/ND6可能与2-C、A-B、A-A的抗氧化损伤作用密切相关。

图9 Glu诱导HT22细胞氧化损伤模型中MB类似物激活Akt/GSK-3β/MEF2D/ND6通路

3 讨论

MB是首个全人工合成的吩噻嗪结构药物，具有广泛的生物活性。近年来，相关研究发现MB类似物具有MB相似的生物活性，包括抗菌作用、调控NO/cGMP信号通路、抑制单胺氧化酶活性产生抗抑郁作用、抗氧化损伤作用等[5-8]。然而，目前MB类似物抗氧化作用及其作用机制研究鲜有报道，深入研究MB类似物的抗氧化作用及其机制，将为该类药物的研发、结构改造及临床应用提供重要的实验依据。

本次研究发现具有酚噻嗪结构的化合物2-C、A-B、A-A具有显著的抗Glu诱导的氧化损伤作用，均在nmol/L浓度水平发挥明显的抗氧化作用，而不具有酚噻嗪结构的NR未显示抗氧化损伤作用。此外，MTT实验结果发现：与MB比较，2-C具有更强的抗氧化损伤作用及更低的细胞毒性。

目前，研究证明MEF2D能够参与神经元的分化并促进神经元存活[16]。多项研究发现MEF2D蛋白水平下调与多种神经退行性疾病有关包括PD、 AD[14，17-19]。如：GUO等[20]研究发现羟黄酮抑制神经元凋亡等神经保护作用与其激活MEF2D有关。YAO等[21]研究认为B3C可通过激活MEF2D，产生保护多巴胺能神经元，改善PD运动缺陷。

机制研究发现Akt/GSK-3β参与调节MEF2D表 达[22-23]。研究发现MEF2D受到GSK-3β的磷酸化修饰，MEF2D磷酸化后通过Caspase途径介导降解[18，24]。

近年来研究发现MEF2D不仅在细胞核中作为转录因子调控基因表达，MEF2D也定位于线粒体，并参与调控线粒体基因表达。ND6是线粒体复合体I的重要组成成分。研究发现ND6基因突变或者ND6蛋白水平下降，可引起线粒体复合体I结构改变进而引起线粒体功能障碍[25-26]。前期研究证明MEF2D可促进线粒体编码蛋白ND6的转录翻译，提高线粒体复合物I活性，从而提高线粒体功能，降低细胞内氧化应激水平[27]。此外，研究结果表明：ND6基因中MEF2结合位点突变则会干扰线粒体复合体I的形成，引起细胞氧化应激损伤。

前期研究发现MEF2D参与MB抗Glu诱导HT22细胞损伤作用，且这一作用可能与MB的中枢神经系统保护作用密切相关[28]。因此，本研究在发现2-C、A-B、A-A具有抗氧化作用的基础上进一步探究了MEF2D与其作用的相关性。我们检测了2-C、A-B、A-A对HT22细胞中MEF2D蛋白水平的影响，并检测了敲低MEF2D后对2-C、A-B、A-A抗氧化损伤作用的影响，结果显示siRNA敲低MEF2D后部分取消2-C、A-B、A-A抗氧化损伤作用，以上结果表明MEF2D参与了2-C、A-B、A-A抗氧化损伤作用。此外，我们采用Western blot法检测2-C、A-B、A-A对Akt/GSK-3β/MEF2D/ND6通路的作用，结果显示2-C、A-B、A-A显著激活Akt，促进GSK-3β磷酸化使其失活，这一作用可能与化合物升高HT22细胞内MEF2D、ND6蛋白水平有关。

综上所述：本次研究通过对2-C、A-B、A-A、NR四种MB类似物的抗氧化作用及其机制进行研究结果进行分析得出：①吩噻嗪结构可能对该类化合物的抗氧化损伤活性起到重要作用；具有吩噻嗪结构的化合物2-C、A-B、A-A与MB具有非常显著的抗氧化损伤活性；②2-C与MB相比具有更低的细胞毒性，且其抗Glu诱导细胞损伤作用效价强于MB；③2-C、A-B、A-A的抗氧化损伤作用可能与其调节Akt/GSK-3β通路，提高MEF2D、ND6蛋白水平，促进线粒体功能有关；以上结果为后续进一步开展MB类似物在氧化应激相关疾病中的研究奠定实验基础，并为MB类似物的合成、结构改造等领域研究提供参考。