猪细小病毒感染的实验室诊断

方振华，沈振国，孙倩

（海南职业技术学院热带农业技术学院 海口 570216）

猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）是导致猪繁殖障碍性传染病猪细小病毒病的病原，该病以造成母猪流产，特别是初产母猪产木乃伊胎、畸形胎、死胎等为主要临床症状[1-3]。PPV 可增殖于猪的多种传代细胞，如猪睾丸（swine testicle，ST）细胞、猪肾（porcine kidney-15，PK-15）细胞，同时造成明显的细胞病变效应[4,5]。该病常发生在种猪生产中，造成养猪业重大经济损失，给畜牧业的健康发展带来严重不利影响。2021 年6 月，海南省某猪场初产母猪发生流产及死胎现象，猪细小病毒PCR 检测为阳性，经临床观察，结合病理剖检变化诊断为猪细小病毒感染。

1 发病情况及剖检变化

2021 年6 月下旬，海南省某猪场初产母猪出现流产、死胎，无其他明显症状。经产母猪也未出现症状。对死胎进行剖检，可见皮下水肿或充血、肝脾肿大等。根据临床表现及剖检变化，初步怀疑为猪细小病毒感染。

2 实验室诊断

2.1 病料处理

流产胎儿的脾脏、肾脏、肠系膜淋巴结等组织，剪碎后研磨，用生理盐水进行5 倍稀释，3 次重复冻融，用5,000r/min 离心15min，再吸取上清液，然后加入双抗冻存起来备用。

2.2 引物的设计与合成

所用试验引物位于猪细小病毒（PPV）VP2 基因内，预期扩增片段为415bp，上游引物：5'-AATACTTGGGGGAGGGCTTG-3'，下游引物：5'-CTAGGTGCTGCTGGTGTGTA-3'。引物序列送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.3 所用试剂及仪器

病毒基因组DNA/RNA 提取试剂盒来自天根生化科技（北京）有限公司；DNA 纯化回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖购自为Sigma 公司；dNTP、DL2000 DNA Marker 等购自大连宝生物工程有限公司；ExTaq 酶购自购自北京全式金生物公司；6× DNA 上样缓冲液（DNA loading buffer，6× ）购自Solarbio life Sciences 公司；猪PK-15 细胞为本实验室保存；胎牛血清为四季青浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM 培养基为Gibco 产品；胰酶消化液购自碧云天（Beyotime）生物试剂公司。主要仪器为超净工作台、生物安全柜、离心机（Thermo Fisher Scientific）、凝胶成像分析仪（Bio-Rad）、PCR 仪（Bio-Rad）、倒置显微镜（Olympus/ 奥林巴斯）等。

2.4 病毒DNA 提取

按照病毒基因组DNA/RNA 提取试剂盒说明书步骤进行操作。在含有20μ L 蛋白酶K 的离心管中加入200μ L 病料上清液，再加入200μ L Carrier RNA 工作液，振荡15s，56℃孵育15min；加入250μ L 无水乙醇，振荡后室温放置5min；将溶液转移至RNase-Free 吸附柱CR2 后，8,000rpm 离心1min，加入500μ L 缓冲液GD，8,000rpm 离心1min，再加入600μ L 漂洗液PW，静置2min后，8,000rpm 离心1min；随后加入500μ L 无水乙醇，8,000rpm 离心1min；最后将吸附柱放入一个RNase-Free 离心管中，室温放置3min，滴加50μ L RNase-Free ddH2O，室温放置5min 后12,000rpm离心1min，收集DNA 样品，-20℃保存备用。

2.5 猪细小病毒VP2 基因的PCR 扩增

模板DNA 2μ L，Premix Taq 12.5μ L，上下游引物（20μ mol/L）各1μ L，用灭菌的ddH2O 补至25μ L。反应程序为94℃预变性5min→94℃变性30s→57℃退火30s→72℃延伸30s，执行34 个循环，结束后72℃延伸10min。反应完毕，取PCR 产物6μ L，加入1μ L 6× DNA 上样缓冲液（DNA loading buffer，6× ），经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，使用凝胶成像分析系统进行拍照。发现PCR 扩增后获得1 条415bp 的特异性条带（图1）。将PCR 产物应用DNA 纯化回收试剂盒进行回收和纯化，纯化后的DNA 送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序分析，测序结果经比对分析，发现与猪细小病毒VP2 基因的同源性为99.5%。以上结果表明待测样品呈现猪细小病毒阳性，再同临床症状和病理变化结合，诊断该猪场病猪为猪细小病毒感染。

2.6 病毒分离培养

将上述处理的病料上清液经0.22μ m 滤膜过滤后接种于PK-15细胞，与此同时，使用正常细胞加以对照，在37℃下吸附1h，加入含2%胎牛血清DMEM 维持液，置于37℃二氧化碳培养箱中培养，然后观察细胞病变，并用PCR 对细胞培养物进行猪细小病毒检测。由结果可知，病料经盲传后，培养96h，PK-15 细胞出现了零星的细胞病变（图2）。将细胞裂解后，收集培养液进行猪细小病毒检测，结果显示，所分离病毒为猪细小病毒。

图2 接种临床样本后，PK-15 细胞呈现的细胞病变

3 讨论

猪细小病毒是单股线性DNA 病毒，无囊膜，基因组全长为4～6.3kb[6]，引起母猪繁殖障碍，导致流产或死胎等，在全球范围内，猪细小病毒是造成猪繁殖障碍的主要致病原之一，对全世界养猪业造成了巨大的经济损失[7]。该病毒适应力较强，耐热，在56℃温度下可存活48h，甚至在70℃下也可存活2h，但80℃经过5min 后该病毒就失去了感染性。此外，该病毒耐受pH 范围广，一般在3.0～9.0 的pH 范围内都可保持较高的稳定性[8]。当健康猪感染猪细小病毒弱毒株后，机体自身可产生免疫反应，往往不会使胎盘感染。但产前母猪具有较高的易感性，特别是初产母猪，其发病率高于经产母猪[9]。

猪细小病毒与其它引起猪繁殖障碍的病原如猪乙脑病毒、猪瘟病毒、衣原体、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等感染后引起的临床表现相近[10]，因此，只根据临床症状常无法诊断，所以需依靠实验室检测才能确诊。临床上对猪细小病毒常采用免疫学方法，如血凝抑制试验，在猪感染猪细小病毒后约1 周左右的时间里，抗体可维持相对较长的时间，抗体检查水平显著提高。血凝试验和血凝抑制试验，虽然不需要借助其他特殊设备，但灵敏性相对较差，操作较为复杂且繁琐，结果判读也可能受到人为因素影响[11]。乳胶凝集试验也是较为常用的检测方法，其特异性较强，并具有敏感性，该法可直接用于抗体检测以及猪细小病毒病的流行病学调查，但该法只能进行定性诊断，却不能有效监测猪血清样本中的抗体滴度。此外，血清中和试验是通过细小病毒与待检血清中的抗体发生中和反应，然后接种细胞，根据病变计算血清的抗体滴度，此法特异性虽较好，但操作过于繁杂[12]。PCR 反应具有特异性强、省时、操作方便、灵敏度高等优点，成为猪细小病毒病诊断的主要方法[13]。猪细小病毒基因中的VP2 基因是一个较保守基因，对猪细小病毒的诊断有着非常重要的意义[14]。本次诊断以采集的流产和死胎胎儿脏器组织为病料，提取DNA 后，应用猪细小病毒VP2 基因的特异性引物，经扩增后获得和预期一致的目的片段，PCR 产物经序列测定发现与猪细小病毒VP2 基因的同源在99.5%以上，由此，可确诊为猪细小病毒感染。

对于猪细小病毒的分离培养，目前还是研究该病的主要基础，接种其特异性的PK-15 细胞，可收获滴度较高的病毒[15]。此次实验室诊断是用无菌操作采集的死胎和流产的器官组织为病料，无菌处理后接种于PK-15 细胞上，出现比较明显的细胞病变是在感染96h 时，细胞培养液经PCR 扩增，也同样出现了猪细胞病毒VP2 基因片段，说明成功分离了猪细小病毒。此诊断结果反馈给养殖场后，管理人员淘汰了阳性经产母猪，隔离阳性初产母猪，并对猪场进行了彻底消毒，加强了免疫接种等综合防治措施，取得了较好的效果。