烟草靶斑病病原生物学与综合防控措施研究进展

祖庆学 张翼飞 冯裕洋

（贵阳市烟草公司开阳县分公司，贵州开阳 550300）

烟草靶斑病（tobacco target spot）由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起，因在烟草叶片上产生环带状坏死斑点而得名，最早于20 世纪初在美国烟区被发现[1]。该病害给许多国家的烟草生产造成了危害和损失[2-3]。20 世纪末，在我国还未发现有烟草靶斑病发生时[4]，烟草病理学专家谈文教授就专门介绍了这种病害在国外暴发流行的情况[3]。 21 世纪初，吴元华等[5]在辽宁丹东烟区进行了烟草靶斑病的调查和系统性的鉴定工作，完成了该病害在我国的最早报道。随后在广西烟区病害调查过程中，在百色、河池和贺州等地的烟草上均发现了靶斑病[6]。针对我国烟草上发生的这种新病害，孙宏宇[7]就烟草靶斑病的流行条件和防治技术措施进行了专题综述，为该病害的防控提供了指导。在这之后，吉林[8]、黑龙江[8]、云南[9]、湖南[10]等烟区也都先后发现了靶斑病，涵盖了我国大部分烟叶生产区。 各地针对这种病害的病原学和综合防治技术措施开展了大量富有成效的工作，积累了宝贵的经验。

立枯丝核菌寄主范围很广，包括了茄科的烟草、茄子、番茄、辣椒，其他科属的黄瓜、西瓜、葫芦、白菜、甜菜等多种农作物以及一些种类的杂草[2，11-13]。该病原菌可以在烟草的所有生长阶段侵染植株[2-3]，还可以引起苗期立枯病[7]。立枯丝核菌具有生活史比较特殊、遗传分化比较复杂等特点[1]，且烟草靶斑病的田间症状还与部分叶斑病等病害存在相似性，这都给靶斑病鉴定识别和防控增加了难度。 本文从烟草靶斑病的识别鉴定、病原生物学、发生流行规律与综合防控措施等4 个方面归纳总结了国内外烟草靶斑病的相关研究，对相关方面仍不明确的方向进行了讨论与展望，以期为烟草靶斑病的快速准确识别与高效绿色防控提供指导，为我国各烟区烟叶生产工作与立枯丝核菌生物学研究等提供参考。

1 烟草靶斑病的识别鉴定

立枯丝核菌侵染叶片组织的最初病状是形成一个直径2~3 mm 的圆形坏死斑点，对着光线能够呈现出网格结构[3，11]。 在适宜的条件下，部分坏死斑点会随着病原菌侵染的加剧而扩展为5 cm 左右的大病斑，外形不规则，深褐色，具有明显的同心轮纹状结构。大病斑中心部分残余叶片组织相对薄脆，容易脱落，使整个病斑如同子弹穿孔过的靶纸，因而该病得名“靶斑病”[2-3，11]。 但是，赤星病等几种真菌性叶斑病中晚期的病状也可以出现同心轮纹病斑，容易造成田间识别的混淆。 Shew 等[2]比较了2 种烟草叶斑病的病状，发现靶斑病的初侵染圆斑非常明显，即使在坏死区域进一步扩大之后也能够看到残留的痕迹，成为区别靶斑病与赤星病的重要依据。靶斑病坏死病斑的周围具有一层黄色晕圈，是病原菌继续侵染的表现[11]，该黄色晕圈在病原菌侵染初期、坏死病斑还是小圆形时期就存在，是靶斑病区分气候斑等非侵染性病害的主要指标。在条件适宜的情况下，烟草靶斑病坏死病斑正反两面都会被一层白色丝状菌丝覆盖，覆盖的密度和范围存在差异，是该病害的重要病征[5]。 在烟草植株上，靶斑病的发生集中在中下部叶片上，当然也会因条件适宜向上部叶片传播，可以达到约1.5 m 的高度[14]。 另外，立枯丝核菌还可以侵染烟草幼苗的根或茎基部，造成溃疡状坏死、断裂，进一步导致苗床大面积猝倒，这个类型的症状被归为烟草立枯病。 烟草立枯病是该病原菌引起的另一种主要的烟草病害，该病害与靶斑病的发生既有联系又有区别。

在光学显微镜下观察烟草靶斑病产生的白色丝状物病征，可以很清楚地观察到立枯丝核菌粗壮的菌丝，宽度约10 μm；菌丝分枝的部位往往非常接近直角，分枝点外部有一定程度的缢缩；菌丝隔膜明显，产生在分枝点附近，但不是在直接分枝的缢缩部位，这种“T”形菌丝分枝结构是立枯丝核菌重要的形态学鉴定指标[12]，也是靶斑病鉴定过程中显微镜观察检测的重点对象。另外，在靶斑病病斑处还能观察到立枯丝核菌的子实体。 立枯丝核菌担子梗的尺寸同普通菌丝接近，顶部膨大的担子宽度可达14 μm[5]，担子的顶端着生4 个无色长椭圆形担孢子（4.0~5.5 μm×7.0~10.0 μm）[1]。

随着分子生物学手段的日渐成熟，转录间隔区间（internal transcribed spacer，简称ITS）等分子标记被应用到烟草靶斑病的病原菌鉴定中，成为传统形态学识别鉴定的重要补充[13，15]。 在此基础上，我国的研究人员开发了一系列基于分子生物学工具的靶斑病快速检测手段。肖艳松等[10]针对立枯丝核菌ITS 区域的特异性片段设计了引物， 使用该特异性引物，根据PCR 反应的产物条带大小就可确定种类，节省了ITS 片段序列测定与数据库比对的时间和成本。赵艳琴等[16]利用TaqMan 探针技术，针对立枯丝核菌的ITS 分子标记，实现了对土壤中病残体的检测；由于结合了实时定量PCR 技术，该检测手段还可以对病残体含量实现定量分析，初步揭示了靶斑病病残体的存留规律。

2 烟草靶斑病的病原生物学

烟草靶斑病的病原菌是立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），最早由德国科学家Kühn 在1858 年描述建立。根据其有性世代担子与担孢子的形态结构特点，该病原菌一度被称作瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris）[1，5]。目前，国际真菌分类系统（Index Fungorum）采用了立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）这一名字来命名该病原菌。 经过许多科学家的补充完善，Sneh 等[17]系统性地总结完善了立枯丝核菌的一系列分类特点，包括菌丝含褐色素、具有“T”形分枝结构、尖端含有多个细胞核以及桶孔隔膜等。 根据形态特点和分子标记的系统进化分析， 立枯丝核菌被归属到担子菌门（Basidiomycota）鸡油菌目（Cantharellales）角担菌科（Ceratobasidiaceae）[18]。 立枯丝核菌在马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，简称PDA）培养基上的菌落培养4 d 之后就会出现浅褐色，菌落周边的菌丝有轻微的色带，但是培养基上没有变色的晕圈[10，19]，这也是该病原菌识别鉴定的一个指标。 人工培养基上的生长试验结果表明，立枯丝核菌营养生长的适宜条件为常温（25 ℃）、中性（pH 值=7）、黑暗和高湿度[20]。 立枯丝核菌可以产生深褐色菌核，人工培养基上的生长试验发现，立枯丝核菌产生菌核的适宜条件为略偏酸性（pH 值5~7）、高湿度（相对湿度90%）和黑暗[20]。 立枯丝核菌在适宜的条件下可进行有性生殖，产生子实体。该病原菌的子实体是担子与担孢子，可以在叶片病斑中产生，也可以在土壤表面的营养物质中产生[3]。立枯丝核菌产生子实体的过程在人工培养条件下不太容易发生[1]，一些研究指出，培养基的碱性条件和培养环境中二氧化碳富集是立枯丝核菌完成有性生殖的关键[21]。

菌丝融合（hyphal anastomosis）是丝状真菌普遍发生的现象，具有一定的遗传物质交流的功能。 Parmeter 等[22]利用立枯丝核菌的菌丝融合现象对该类群进行了划分，建立了菌丝融合群（anastomosis group，简称AG）的体系。Ogoshi[23]与Sneh 等[17]又先后对立枯丝核菌菌丝融合群的体系进一步完善，基本明确了各个融合群的范围。病害研究中，通常采用载玻片定位融合法来观察立枯丝核菌菌丝融合现象， 即将标准融合群菌株与待测菌株在放有载玻片的培养基上对峙培养，属于相同融合群菌株的菌丝接触之后，可以在显微镜下观察到细胞壁溶解与细胞质融合的现象，比较典型的融合反应还包括了细胞核的流动[13]。进入21 世纪，ITS 分子标记也被应用到立枯丝核菌菌丝融合群体系区分中[15]，并且能够与多个融合群的鉴定结果相匹配[1]，给融合群的鉴定提供了便利。另外，在部分融合群的鉴定中，一些传统的菌丝融合不明显的类别也可通过ITS 的序列分析进行完善[24]。González-García 等[12]结合分子标记系统发育理论更新了立枯丝核菌融合群划分体系，对相关的划分依据也进行了完善。

烟草靶斑病一些比较久远的报道没有进行菌丝融合群的划分[11]。 开展相关的分析之后，美国烟区早期报道的几例立枯丝核菌根据菌丝融合反应被鉴定为融合群AG-2-2[11]，后续一些研究中分离到的融合群也是这个融合群[24-25]。 最早被鉴定为融合群AG-3的立枯丝核菌是在南非烟区分离得到的烟草靶斑病的病原菌[14]。 随后，在美国烟区也根据菌丝融合反应鉴定到了融合群AG-3[19]，并且该融合群的发生也出现了上升趋势[26-27]。 近年来，阿根廷烟区靶斑病病原菌先后鉴定出了融合群AG-2-1[28]和AG-4[29]，具有一定的独特性。在我国烟区，辽宁省的丹东和铁岭烟区分离得到的病原菌根据菌丝融合反应和ITS 分子标记被鉴定为融合群AG-3，开启了我国立枯丝核菌融合群归属问题的研究[30]。 在这之后，在东北地区吉林通化烟区、黑龙江哈尔滨和牡丹江烟区[8]与西南地区云南临沧和普洱烟区[9]，也分离得到并鉴定出了属于融合群AG-3 的立枯丝核菌菌株，确定了这一融合群在我国分布范围广泛。除此之外，我国烟区也有其他融合群的报道。广西壮族自治区百色、河池和贺州烟区分离得到的引起靶斑病的立枯丝核菌，经过与标准菌丝融合和ITS 序列分析发现，属于融合群AG-2-2 和AG-4，这2 种融合群在我国其他地区还没有被报道[6，31]。

3 烟草靶斑病的发生流行规律

烟草靶斑病具有潜育期短、流行速度快的特点，在环境条件适宜时可以反复侵染、大面积传播，造成严重危害[5]。 立枯丝核菌主要在土壤中完成越冬。 根据目前的研究，立枯丝核菌在土壤中的残留可归纳为3 种形式。 一是立枯丝核菌寄主范围较广[12，20]，除了烟草外，还有多种烟草产区常见的农作物和烟田周边容易出现的杂草等可以作为立枯丝核菌的寄主，使其完成越冬存留的过程。 二是立枯丝核菌在不利环境条件下可以产生结构坚固、抗逆性强的菌核结构，能在土壤中存活比较长的时间。三是立枯丝核菌也可营腐生生活，直接利用土壤中的有机质存活[1]。Gutierrez 等[32]研究发现，栽种过前茬感病烟株的器皿约84%存在立枯丝核菌的病残体，其中约63%的器皿病残体可以存活1 年，这些病残体主要包括了休眠菌丝和菌核，平均残留深度约为1 cm。存活下来的休眠菌丝和菌核在条件适宜的情况下可于土壤表面或者病残体周围发育出子实体，产生担孢子，完成侵染循环的初侵染过程。

立枯丝核菌侵染烟草叶片主要是采取直接侵入的方式。 首先，担孢子在烟草叶片表面萌发，产生一根芽管和吸器，稳定地附着到叶片表面。 然后，立枯丝核菌突破烟叶表面的角质层和表皮组织的细胞壁，侵入表皮组织细胞中，并形成一团具有不同形状和大小的侵染体[12]。 在这个过程中，立枯丝核菌会产生大量蛋白酶、几丁质酶、糖苷酶和磷脂酶等胞外水解酶，协助直接侵入过程[33]。 立枯丝核菌的菌丝直接从气孔侵入的过程也被观察到[25]。在田间人工接种立枯丝核菌担孢子的试验表明，烟草叶片在侵染12 h后就可以产生初侵染病斑[34]。 立枯丝核菌的侵染体在条件适宜的情况下，会进一步向周边组织逐步扩散：在微观层面上，是周边组织细胞质基质成分发生变化，导致叶肉细胞坏死；在宏观层面上，表现为叶肉组织分批坏死，最终形成同心轮纹状坏死病斑[12]。刘欣茹等[34]开展连续观察试验发现，烟草靶斑病病斑从发生到最终形成穿孔需要7~8 d。烟草靶斑病病斑上发育的子实体可以产生担孢子，完成侵染循环的再侵染过程。

国内多项研究表明，烟草靶斑病发生与发展适宜的环境条件是高湿度，其发生往往与烟区连续降雨有关。美国烟区20 世纪80 代中期靶斑病大流行，推测同前一年夏天的极端暴雨天气存在关联[11]。 我国辽宁烟区21 世纪初首次报道靶斑病的案例中，烟区也出现了生长季节降水多、田间相对湿度高的情况[5]。 刘欣茹等[34]在云南烟区开展的担孢子接种试验发现，担孢子在相对湿度100%的情况下可以很快地完成侵染过程。 曹哲铭等[35]在吉林烟区开展了靶斑病流行规律分析，通过使用数学模型拟合病情指数随时间发展的变化趋势发现，体现病害较快增长的逻辑斯蒂模型（logistic model）最符合靶斑病的发生规律。根据相关系数分析，吉林烟区5 月和6 月的降雨量和湿度是影响靶斑病流行最重要的指标。

4 烟草靶斑病的综合防控措施

美国烟区开展的大批量烟草种质资源筛选试验表明，烟草对立枯丝核菌的抗病性有限，可以选用的抗病品种不多[36]，因而农业防治是病害综合防控的重要组成部分。目前，国内外主要的烟草种植产区均进行烟苗的培育和移栽，育苗设备和基质（尤其是连续使用的设备和基质）必须经过充分消毒才能最大限度地避免病残体的留存[32]。 土壤改良也是破坏靶斑病田间流行循环的手段[37]。 在阿根廷烟区，根据病情指数的记录和实时定量PCR 的测定发现，使用桉树枝条诱集、换用不发病田块和非农业用地田块的土壤就可以有效抑制靶斑病的发生。 这个现象可能与土壤中有机质与拮抗细菌的含量相关[38]。

化学农药的使用仍然是烟草靶斑病最为有效的防控方式[1]。 孙宏宇[7]在我国烟草靶斑病开始被发现时就专题综述了国外已经开展的一些化学防治技术。在这之后，我国辽宁烟区也开展了许多药效试验，取得了大量成果。 国内烟草靶斑病被报道之后，伏 颖等[39]选用10 种杀菌剂进行立枯丝核菌的室内毒力测定，结果表明，烯唑醇的抑菌效果最好，其他4 种药剂也表现出了一定的抑菌效果。 在辽宁烟区，50%腐霉利·噁霉灵800 倍液对烟草靶斑病能达到60%的相对防效，相关配方也已优化出来[40]；间隔7 d 施用2 次苯醚甲环唑·丙环唑和20%噻氟酰胺能达到70%以上的相对防效[41]。 这些药效试验的结果值得我国各地烟区在靶斑病防治时借鉴。

许多研究表明，一些物理防治和生物防治方法也具有良好的烟草靶斑病防控效果。在美国烟区，干热风（70~80 ℃）处理可以达到很好的苗床消毒效果，基本能够消除立枯丝核菌[32]。 在津巴布韦，从土壤中筛选出的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）菌株T77被扩繁之后添加到化学杀菌剂中控制苗期的立枯丝核菌[42]。 从我国辽宁烟区的植烟土壤中分离筛选到的灰色链霉菌（Streptomyces griseus）菌株S128 经过扩大发酵之后对立枯丝核菌具有同商业菌株接近的抑菌效果[43]，另一株淀粉酶产色链霉菌（S.diastatochromogenes）菌株TA1123 抑菌活性物质的代谢过程也得到了研究[44]。生物农药嘧肽霉素和多抗霉素的复配液（1.8%）可以显著抑制立枯丝核菌菌丝的生长，通过电导率测定，基本揭示了生物农药对病原菌细胞膜通透性产生负面影响的作用机理[45]。

5 展望

烟草靶斑病于21 世纪初在我国被发现之后，在辽宁、吉林、黑龙江、广西、云南和湖南等烟区都有发生。 在国外开展的烟草靶斑病的流行条件和防治技术措施等相关研究的基础上[7]，我国烟区也积累了许多关于病原学与综合防控措施的成果。目前，立枯丝核菌的侵染与传播途径基本明确，流行暴发所适合的高湿度条件在国内外烟区的研究成果中也吻合，极端天气之后的预防性施药应该是防治的重要节点。 立枯丝核菌的融合群分化具有一定的寄主倾向性[20]，目前在国内外的分布规律也不完全一致，引起烟草靶斑病和烟草立枯病的融合群也存在着一些差异[19]，成为相关领域深入研究的一个方向。另外，我国辽宁等烟区筛选出若干对靶斑病防控效果明显的低毒杀菌剂，值得其他地区借鉴，而筛选的生防剂型成为绿色防控的重要组成部分。在烟叶生产中，靶斑病应与赤星病等其他真菌类叶斑病害统防统治。