HPLC-RID法测定食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的方法学验证

李琼

（山西省食品研究所（有限公司），山西太原 030024）

糖类是自然界最多的有机化合物，是食品中的重要风味成分和营养成分，其种类和含量是评价食品品质的重要质量指标。在食品加工工艺中，糖类对改变食品的形态、组织结构、物化性质以及色、香、味等感官指标起着十分重要的作用。因此，准确测定食品中各种糖的含量对食品品质改良、加工储藏技术选择、新产品开发等都具有重要意义。

随着检测技术的蓬勃发展，越来越多的检测手段被运用到糖类检测中，而高效液相色谱法因其高效、高灵敏度、重复性好等优点，被广泛用于产品中多种糖含量的测定中。我国现行的相关检测标准有GB 5009.8—2016《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》，其第一法高效液相色谱-示差折光检测（HPLC-RID）法适用于谷物类、乳制品、果蔬制品、蜂蜜、糖浆、饮料等食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的测定。为了获得稳定、可靠和准确的数据，本试验从校准曲线、检出限、正确度、精密度等方面对该方法在本实验室的适用性进行了验证。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

样品：沙棘汁饮料、蒙牛酸酸乳、丽美思红枣浓浆、丽和堂蜂蜜、娃哈哈雪碧、娃哈哈雪碧纤维+、麻花，均购于当地超市。

试剂：乙腈，色谱纯；乙酸锌、亚铁氰化钾，分析纯；石油醚，沸程30 ℃～60 ℃。

标准品：果糖，CAS 号:57-48-7，纯度99.7%；葡萄糖，CAS号:50-99-7，纯度99.7%；蔗糖，CAS号:57-50-1，纯度99.7%；麦芽糖，CAS 号:69-79-4，纯度94.4%；乳糖，CAS 号:63-42-3，纯度99.5%。

仪器：1260 液相色谱仪，带示差折光检测器，配氨基色谱柱（柱长250 mm，内径4.6 mm，膜厚5μm），安捷伦科技有限公司；KS-5200DE 液晶超声波清洗器，昆山洁力美超声仪器有限公司；BSA224S 电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；AXTGL16M 台式高速冷冻离心机，盐城市安信实验仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

1.2.1.1 沙棘汁饮料、酸酸乳、红枣浓浆

称混匀后的试样5 g（精确到0.001 g）于100 mL容量瓶中，加水约50 mL 溶解，缓慢加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各5 mL，定容至刻度，超声30 min，过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜过滤至样品瓶，上机测定。

1.2.1.2 蜂蜜

称取混匀后的试样1 g（精确到0.001 g）于50 mL容量瓶，加水定容至50 mL，充分摇匀，过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜过滤至样品瓶，上机测定。

1.2.1.3 雪碧

将混匀后试样倒入蒸发皿中，在水浴上微热搅拌去除二氧化碳，吸取50.0 mL 移入100 mL 容量瓶中，缓慢加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各5 mL，定容至刻度，摇匀，静置30 min，过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜过滤至样品瓶，上机测定。

1.2.1.4 麻花

称取10 g（精确到0.001 g）粉碎均匀的试样于100 mL 具塞离心管中，加入50 mL 石油醚，振摇2 min，1 800 r/min 离心15 min，去除石油醚后重复以上步骤至去除大部分脂肪。蒸发残留的石油醚，将样品转移至100 mL 容量瓶中，用50 mL 水分2 次冲洗离心管，洗液并入100 mL 容量瓶中，缓慢加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各5 mL，定容至刻度，超声30 min，过滤，滤液用0.45μm 微孔滤膜过滤至样品瓶，上机测定。

1.2.2 标准溶液配制

分别称取上述经过96 ℃干燥2 h 的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖各5 g，加水定容于250 mL，配制成质量浓度20 mg/mL 糖标准贮备液，分别稀释成质量浓度1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、6.0 mg/mL、10.0 mg/mL标准使用溶液。

1.2.3 仪器条件

流动相：乙腈+水=70+30（体积比）；流动相流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：20μL；示差折光检测器条件：温度40 ℃。

1.2.4 试验方法

将标准系列工作液分别在上述色谱条件下进行测定，以标准工作液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并对校准曲线进行分析。分别测定沙棘汁饮料、酸酸乳、红枣浓浆、麻花等样品中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖，选出合适的样品进行加标回收、精密度、重复性等验证试验，并对测定数据进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 校准曲线

果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖标准系列线性方程及相关系数测定结果见表1。

表1 线性方程及相关系数

由表1 可知，在质量浓度1.0 mg/mL～10 mg/mL范围内，5 种糖标准曲线的相关系数均＞0.99，满足GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中校准曲线的要求。

2.2 样品测定结果

在相同的液相色谱条件下，分别将制备好的试样溶液注入高效液相色谱仪中，测定结果见表2。

表2 样品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖测定结果

2.3 回收率试验

以雪碧纤维素+为检测对象，准确吸取50.00 mL样品9 份，分别加入糖标准贮备液（其中果糖、麦芽糖质量浓度20.6 mg/mL、葡萄糖蔗糖20.0 mg/mL、乳糖20.80 mg/mL）3.0 mL、20.0 mL、40.0 mL，进行3 组回收率试验，每组3 份，按1.2.1.3 处理后进行测定。分别计算果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖不同添加水平的平均回收率，试验结果见表3。

表3 方法回收率试验结果

由表3可知，3个添加水平果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖的含量均＞100 mg/kg，回收率均在95.83%～104.75%范围内，回收率符合GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中回收率的要求，即被测组分含量＞100 mg/kg，回收率范围为95%～105%，表明该方法回收率良好，能满足实验室分析检测的要求。

2.4 精密度试验

以雪碧纤维素+为检测对象，准确吸取50.0 mL样品3 份，分别加入质量浓度为20.0 mg/mL 的糖标准贮备液3.0 mL、20.0 mL、40.0 mL，按1.2.1.3 处理后进行测定，每个浓度水平重复测定6 次，计算相对标准偏差（RSD），结果见下页表4。

表4 方法的精密度试验

由表4 可知，该方法在低、中、高3 个添加水平5 种糖测定结果的RSD范围分别为2.45%～2.61%、0.94%～1.13%、0.62%～1.00%，满足GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中精密度的要求，即被测组分含量为0.1%～1%范围内，RSD＜3.8%；被测组分含量在1%～10%范围内，RSD＜2.7%。

2.5 重复性试验

以雪碧纤维素+为检测对象，准确移取50 mL样品6 份，各加入糖标准贮备液10.0 mL，按1.2.1.3 处理，测定其重复性，计算相对标准偏差（RSD），方法的重复性试验结果见表5。

由表5 结果可知，该方法重复性良好，RSD为1.01%～1.99%，符合GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中精密度的要求。

表5 方法的重复性试验

2.6 方法检出限

根据GB 5009.8—2016 中检出限要求，以雪碧纤维素+为检测对象，准确吸取50.00 mL 样品2份，分别加入1mL 质量浓度为20.0 mg/mL 的糖标准贮备液，按1.2.1.3 处理后上机测定，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定结果分别为0.050 g/100 mL、0.080 g/100 mL、0.042 g/100 mL、0.040 g/100 mL、0.050 g/100 mL，均有结果检出，表明能满足标准中检出限的要求。

3 结论

试验结果表明，校准曲线在1.0 mg/mL～10 mg/mL范围内线性良好，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的线性方程分别为y=164 343.957 97x-3 536.278 98、y=140 125.076 95x+9 569.939 39、y=173 951.655 64x-456.633 10、y=131 176.391 06x+2 527.364 22、y=104 646.710 56x-1 114.805 84，相关系数分别为0.999 99、0.999 50、1.000 00、0.999 72、0.999 80；加标回收率为95.83%～104.75%，精密度试验在低、中、高3 个添加水平5 种糖测定结果的RSD范围分别为2.45%～2.61%、0.94%～1.13%、0.62%～1.00%，重复性试验RSD为1.01%～1.99%，验证结果满足GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中相关要求。该方法线性良好、易操作、重现性良好、测量结果准确，能够满足实验室检测需求。