肿瘤疾病中MMP2与MMP9作为液体活检的生物标志物

江鲜雨，裴世敏

（海南大学动物科技学院，海南海口 570100）

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是一个三维大分子网络，为邻近细胞提供生化和结构帮助。ECM不仅能够调节细胞生长、分化、迁移、存活和内环境稳定等多种生理活动，还与多种疾病的多种病理事件有关。ECM主要由糖蛋白、酶、多糖和水组成，ECM中主要存在的糖蛋白是蛋白多糖、胶原蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白等。胶原蛋白是ECM的主要组成部分，主要存在于动物的结缔组织中，是一种纤维糖蛋白。胶原家族由29个（Ⅰ型胶原至ⅩⅩⅨ型胶原）不同的同三聚体或异三聚体多肽分子组成，其中Ⅰ型至Ⅲ型胶原是形成原纤维的胶原，主要负责向间质基质提供拉伸强度；Ⅳ、Ⅶ和ⅩⅩⅧ型胶原主要负责形成类似于基底膜的纤维网状结构[1]。

基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein，MMPs）家族既能够参与正常生理过程中细胞外基质的分解，如胚胎发育、生殖和组织重塑；也可参与疾病过程如炎症反应、肿瘤中血管生成[2-7]。大多数MMPs以非活性蛋白前体的形式分泌，细胞外蛋白酶将其分裂后被激活。MMP2和MMP9属于基质金属蛋白酶家族的明胶酶类，为Ⅳ型胶原酶，能够降解细胞外基质中的明胶成分，参与肿瘤的转移过程[8]。许多研究证明，发生肿瘤后机体组织中MMP2和MMP9表达异常。有研究发现，MMP9是细胞外基质和基底膜的重要调节因子之一，MMP9的表达会促进上皮细胞的分化和增殖[9]。MMP2在前列腺癌表达中上调，荟萃分析显示，MMP2丰度越高，癌症预后越差[10]。在肿瘤组织中，基质金属蛋白酶已被显示为肿瘤侵袭和预后的特征性标志[11]。但在犬乳腺癌等肿瘤疾病中，MMP2和MMP9的预后作用尚不明确。

1 MMP2和MMP9的功能

MMP2和MMP9统称为明胶酶。MMP2被称为明胶酶A，MMP9被称为明胶酶B。明胶酶在结构上与MMP家族中的其他蛋白酶相似，但具有一个独特的胶原结合域。该胶原结合域由催化域N端的3个纤维连接蛋白Ⅱ型串联重复序列组成，为明胶结合所需[12]。明胶酶通常由成纤维细胞、血管平滑肌细胞和白细胞分泌，MMP2主要由内皮细胞、白细胞、血小板、单核细胞、软骨细胞、成骨细胞、真皮成纤维细胞和角质形成细胞分泌，而MMP9则由上皮细胞、成纤维细胞、多形核白细胞、粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞、成骨细胞、树突状细胞和角质形成细胞分泌[13]。明胶酶主要消化Ⅳ型胶原和明胶，但也能够降解其他类型的胶原，如Ⅴ型、Ⅷ型、Ⅹ型、Ⅺ型和ⅪⅤ型胶原[13]。

MMP2分两个阶段分解胶原蛋白：第一阶段中MMP2的作用类似于间质胶原酶；第二阶段中变性胶原蛋白或明胶在纤维连接蛋白样结构域的协助下被消化[12-13]。MMP9也主要消化明胶和Ⅳ型胶原。明胶酶可处理多种非胶原ECM蛋白质，如纤维连接蛋白、弹性蛋白、聚集蛋白聚糖、蛋白多糖核心蛋白和巢蛋白等[14]。此外，明胶酶还负责激活其他几种非基质蛋白，如成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）、胰岛素样生长因子结合蛋白-3和-5（IGF-BP-3和-5）、白细胞介素-1b（IL-1b）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和转化生长因子-b（TGF-b）[12]。MMP2和其他几种MMP已被证明可蛋白水解激活TGF-β，促进上皮间质转化（EMT）。上皮间质转化不仅与ECM紧密相关，同时也被认为是一个癌症转移的关键过程[15]。MMP2可在蛋白酶细胞外激活，也可在细胞内激活。MMP2被认为参与多种途径，包括作用于神经系统以及调节血管化和转移等。

MMP9的主要功能是降解和重塑细胞外基质的动态平衡。MMP9具有许多作用底物，如Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅶ型、Ⅹ型、Ⅺ型胶原以及蛋白聚糖的核心蛋白、明胶、弹性蛋白等，细胞因子及其受体也是MMP9作用的底物。MMP9是以酶原的形式从胞内分泌到胞外，在体外通过有机汞制剂反应才具有活性，在体内则可经一系列蛋白酶级联激活。此胶原蛋白结构域可被MMP3、MMP2或次氯酸裂解，而非纤维蛋白溶酶、凝血酶或者MMP1。MMP9能够分解呼吸道和肺内的结构复合物，如ECM和基底膜,既能够参与呼吸道和肺的重建，还能够调节其他蛋白酶及细胞因子的活性，降解α1抗胰蛋白酶，保护中性粒细胞弹性蛋白酶活性,加强胶原质胶体中胶原细胞和MMP13的溶胶原活动，还能够抑制一些中性粒细胞的趋化因子。此外，MMP9结合CD44可释放储存的TGF-β1，MMP9还可通过释放血管内皮生长因子（VEGF）以参与血管生成[16-17]，血管的生成有利于肿瘤的发展。

肿瘤的转移过程依赖细胞外基质的降解，MMP2和MMP9可加速细胞外基质的降解，使肿瘤细胞更容易发生转移。转移是肿瘤侵袭的重要途径，大部分恶性肿瘤均具有极强的转移性。因此，MMP2和MMP9在肿瘤疾病中多呈现上调，能够加快肿瘤的转移。MMP2和MMP9与多种肿瘤的发生和发展密切相关，通过调控肿瘤细胞生长、分化、侵袭、调节肿瘤血管生成及免疫监视中发挥重要作用。

2 MMP2和MMP9作为生物标志物

肿瘤的生物标志物具有重要功能，生物标志物可作为肿瘤的预测指标应用于肿瘤的早期发现，如肿瘤普查、筛查，肿瘤的诊断、鉴别诊断与分期，肿瘤患者手术、化疗、放疗疗效监测，肿瘤复发的指标，肿瘤的预后判断以及寻找不知来源的转移肿瘤的原发灶。目前，已被发现的肿瘤标志物包括血清癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、前列腺特异抗原（PSA）和绒毛膜促性腺激素（HCG）等。

MMP9不仅能够促进血管生成，也可增强血管的通透性，导致炎症相关细胞因子更容易通过血管[18]。Ⅳ型胶原蛋白作为细胞外基质和基底膜的主要成分，在被胶原酶切割后进一步被MMP2和MMP9降解，该过程是肿瘤侵袭和转移的关键环节[12]。研究表明，多种肿瘤组织中，MMP2和MMP9的表达上调参与到肿瘤疾病进展[19]。有研究表明，MMP9表达与胸主动脉瘤的潜在治疗靶点相关[20]。抑制MMP9蛋白能够作为肿瘤治疗的靶点，一些靶向和抑制MMP9蛋白的理想先导化学物可应用于透明细胞肾细胞癌的靶向治疗[21]。MMP9表达水平升高也与胃癌密切相关[22]。因此，MMP2和MMP9被认为是肿瘤发生过程中潜在的生物标志物，同时也作为细胞外基质重塑的关键效应物以及抗肿瘤治疗的重要潜在靶点。

肿瘤能够通过外周血的循环而发生转移，而肿瘤组织中MMP2和MMP9可能会释放到外周血中促进肿瘤转移，成为血液中的肿瘤标志物。血清中MMP2和MMP9的上调极大可能预示着肿瘤的转移和发展情况。已有研究证表明，循环肿瘤细胞和MMP9之间具有相关性，且二者联合分析可作为肿瘤转移和预后的指标[23]。对MMP2和MMP9进行抑制也会抑制肿瘤的发展[24]。

血液系统恶性肿瘤可以定义为影响血液、骨髓和淋巴结的造血细胞不受控制地增殖或扩张[25]。世界卫生组织登记的150多种血液系统恶性肿瘤中有3种主要类型的血液恶性肿瘤或血癌，包括白血病、淋巴瘤和黑色素瘤，均与明胶酶的活性相关[26]。MMP14和低浓度的TIMP-2负责MMP2的激活，而组织蛋白酶G、胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽原、弹性蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶和MMP（MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP10、MMP13和MMP26）等酶则负责MMP9的激活。TIMP1与血红素蛋白酶结构域pro-MMP-9相互作用，保护潜在的MMP9不被其他MMP或酶激活[27-28]。明胶酶的活性越高，对血液系统恶性肿瘤越不利。研究表明，MMP2和MMP9在实体恶性肿瘤中作用广泛；有报道称，MMP9的分泌与白血病细胞侵袭增加有关[29]。越来越多的研究表明，明胶酶对血液肿瘤的生长、侵袭和转移具有重要意义。

3兽医领域的液体活检与MMP2和MMP9

在肿瘤性疾病的诊断中，肿瘤标志物（tumor marker，TM）已经成为肿瘤早期诊断的研究热点之一。除了组织中的肿瘤标志物外，血液中也可能存在肿瘤标志物。研究表明，在犬的淋巴瘤病例中MMP9的活性形式与病例分析指标——有丝分裂指数之间呈正相关[30]。在犬乳腺肿瘤病例中，对25例炎性乳腺癌和15例非炎性乳腺癌肿瘤进行免疫组化染色，发现MMP9在犬炎性乳腺癌中的表达可能导致核多形性增加，但生物学机制有待进一步研究[31]。

研究表明，犬猫骨肉瘤的转移与MMP2和MMP9的水平和活性有关。大多数犬骨肉瘤中MMP9水平升高，且活性MMP2的值显著较高[32]。MMP2和MMP9可能会促进犬阴囊内血管瘤的进行性血管生成，并导致肿瘤复发。因此，血清MMP2和MMP9的活性程度可作为预测犬阴囊内血管瘤复发的无创性预后指标；但是通过多变量分析显示，血清MMP2和MMP9的活性程度不是独立的预后因素[33]。血清TM需具有一定的特异性,且在不同肿瘤组织中的表达存在较大的差异，方可作为犬肿瘤性疾病的早期诊断依据，使用TM联合检测可显著提高犬恶性肿瘤的检出率[34]。综上所述，血液中的MMP2和MMP9可作为潜在的肿瘤检测标志物，且血液中的TM更便于检测，TM在犬肿瘤性疾病的诊断中具有较好的辅助诊断作用。随着更多特异的TM不断被发现以及检测技术不断提高，多项TM的联合检测将会在犬肿瘤性疾病诊断的领域中发挥更加重要的作用[35]。

4 结论

近年来，肿瘤性疾病的发生率逐年增高。在犬的肿瘤疾病中，乳腺肿瘤、肥大细胞瘤、黑色素瘤、淋巴瘤等较为常见，具有高转移性和高致死率。晚期的肿瘤治疗相对困难，找到能够在初期诊断出肿瘤的方法有助于早期的肿瘤治疗。同一肿瘤可含有多种TM，而不同肿瘤或同种肿瘤的不同组织类型可含有不同的TM，多项TM联合检测可弥补单项TM的不足，提高肿瘤检出率。在动物肿瘤疾病中，MMP2和MMP9参与炎症反应，并促进肿瘤的生长、转移和侵袭。因此，MMP2和MMP9可能作为检测肿瘤的标志物应用于兽医临床。通常检测肿瘤的方式是细针穿刺抽吸以及组织活检进行肿瘤标志物的检测，大多数检测方法对动物机体具有侵入性，而血液中的肿瘤标志物可作为非侵入性的检测方法应用于小动物肿瘤的临床诊断，找到血液中的肿瘤标志物对临床检测肿瘤具有重大意义。